«Определение эффективности различных способов получения безвирусного материала картофеля с помощью метода ифа»

Вирусные болезни картофеля не поддаются лечению в ходе вегетативного цикла. Перенесение вирусов картофеля осуществляется: механическим контактным путем, грибами, различными видами тлей. Борьба с вирусными инфекциями сводится к использованию здорового посадочного материала, а также ограничению жизнедеятельности насекомых переносчиков (Иванюк с и др., 2005).

Известно, что вирусы картофеля распространяются по флоэмным элементам, и на этом свойстве основано оздоровление растений in vitro. Считается, что апикальные меристемы побегов свободны от вирусов, т.к. в них нет дифференцированных флоэмных элементов.

Концентрацию вирусов можно снизить также, выдерживая растения при различных температурных режимах (термотерапия), или обрабатывая их веществами, ингибирующими развитие вирусов (хемотерапия). В сочетании с термо- и хемотерапией (обработка растений) метод верхушечной меристемы в настоящее время является наиболее эффективным способом оздоровления растений (Артюхова,2015).

Для оценки поражения вирусами растений используют различные методы: визуальный метод, метод электронной микроскопии,

серологический метод и ПЦР анализ.

Актуальность проблемы: Картофель является одной из главных продовольственных культур в России, но урожайность остается низкой. Одна из основных причин это - посевной материал с содержанием вирусной инфекции. Для получения безвирусного картофеля наиболее распространенным способом является культура апикальных меристем, с различными предварительными воздействиями на донорские растения. Данная работа направлена на определение эффективности элиминации вируса при термообработке разной продолжительности и размера экспланта с помощью ИФА.

Цель исследования: проанализировать растения регенеранты

полученных при различных вариантах термообработки и при различных размерах экспланта на X и Y вирусы картофеля.

Задачи:

1. Размножить растения-регенеранты прошедшие различные варианты термообработки и полученные с помощью культуры меристемы различного размера.

2. Провести иммуноферментный анализ на наличие X вирусы картофеля в растениях-регенерантах.

3. Провести иммуноферментный анализ на наличие Y вирусы картофеля в растениях-регенерантах.

4. Разработать рекомендации по методике применения теоретического и практического материала, используемого в ВКР, в школьном курсе "Биология".

Новизна: впервые применен комплексный подход к элиминации вируса при различных вариантах термообработки растений-доноров верхушечной меристемы различного размера.

Научно-практическая значимость: текущий контроль при различных методах предобработки биоматериала на наличие различных типов вирусов является неотъемлемой частью технологии получения безвирусного посадочного материала

Апробация. По материалам данной выпускной квалификационной работы подготовлена и опубликована статья Абрамов С.Н., Галикеева Г.Ф., Губайдуллина Л.Д., Климина Е.В., Магасумова Ю.Р. Разработка технологии получения посадочного материала картофеля свободного от X и Y вирусов комбинированным способом// В международном научном журнале “Colloquim-journal” №14(38), 2019, индексируемом в РИНЦ.

Работа выполнена на кафедре генетики Башкирского государственного педагогического университета им. М. Акмуллы. Выражаю искреннюю благодарность своему научному руководителю Абрамову С.Н за оказание практической помощи при выполнении выпускной квалификационной работы, а также профессору Горбуновой Валентине Юрьевне за предоставленную мне возможность работать в данном научном направлении.

Через указанные промежутки времени апикальные меристемы различного размера вычленяли из побегов и инокулировали на различные варианты питательной среды MS различающейся по концентрации фитогормонов.

Данный этап работы, а именно термообработка, стерилизация и выделенных апикальных меристем из побегов и инокуляция на питательную среду проводились Губайдуллиной Лилианы.

Для наработки биомассы растения-регенеранты были размножены микроклональным способом на среде MS.

2. В качестве положительного контроля использовали молодые проростки клубней того же картофеля из которого получали меристемы для культивирования in vitro.

Рис 1.2. Проростки картофеля 

3. В качестве отрицательного контроля использовали растения картофеля сорта «Дева», выращенного из семян:

4. в стерильных условиях, т.е. семена были простерилизованы, затем в стерильных условиях на безгормональной и безуглеводной среде MS проращивали.

Рис. 1.2. Пророщенные семена

-в условно-стерильных условиях, т.е. семена не простерилизовались, высаживались в почво-грунт.

Рис. 1.3. а-картофель выращенный из семян, в условиях in vitro, б- картофель выращенный из семян, в условиях in vivo

2.2. Методы исследования

2.2.1. Стерилизация объектов и инструментов

Стерилизацию семян осуществляли 70%-м спиртом с последующей стерилизацией в 0,5 %-ой перекиси водорода.

Стерилизатор удаляли трехкратной промывкой ростков автоклавированной дистиллированной водой.

Металлические инструменты и стеклянную посуду стерилизовали автоклавированием при 1.5 атм. в течение 30 мин. Кроме этого, инструменты непосредственно перед использованием трижды обжигали в пламени спиртовки.

Ламинарный бокс стерилизовали согласно инструкции.

Подробная технология стерилизации, а именно время стерилизации, концентрации стерилизующих агентов и время отмывки от стерилизующих агентов были отработаны в 2016-2017 году Ишкининой Людмилой (Ишкинина, 2017)

2.2.2. Методы клонального микроразмножения

В работе использовали питательную среду по прописи Т. Мурасиге и Ф.Скуга (Murasige, Skoog, 1962), приведенной в таблице 2.1.

Экспланты переносили в стерильных условиях ламинарного бокса в пробирки с питательной средой. Высаженный материал культивировали при естественном освещении, 22°С и относительной влажности 70-80 %. Через 1 неделю культивирования отбирали инфицированные экспланты, а через 3 недели - визуально оценивали морфологические показатели.

Концентрации регуляторов роста для органогенеза из морфогенных каллусов и индукции органогенеза брали БАП 1 мг/л, ИУК 0,5 мг/л (Калашникова, 2006). 

Таблица 2.1

Состав стандартной питательной среды МС

Вещества, входящие в состав среды Концентрация, мг/л

NH4NO3 1650

KNO3 1900

СаС12*2Н2О 440

MgSO4*7H2O 370

КН2РО4 170

KJ 0,83

Н3ВО3 6,2

ZnSO4*7H2O 8,6

Na2MoO4*2H2O 0,25

СоС12*6Н2О 0,025

MnSO4*4H2O 22,3

FeSO4*7H2O 27,8

CUSO4*5H2O 0,025

Na2 ЭДТА*2Н2О 37,3

Инозит 100

Глицин 2

Сахароза 30000

Модификация для микроразмножения побегов картофеля черенкованием

Аденин 40

Мезоинозит 100

Тиамин 1,0

Пиридоксин 1,0

ГК 2,0

Никотиновая кислота 2,0

Пантотенат кальция 10,0

Активированный уголь 10000

БАП 1

ИУК 0,5

2.2.3. Условия проращивания семян нестерильных семян

Семена предварительно замачивали, после начала прорастания, высаживали на почвенный субстрат на основе покупного торфяного грунта с добавлением вермикулита (Юсупова,2015).

Семена выращивали при естественном освещении в течение 3 недель в

Апреле месяце.

Минеральное питание осуществляли поливом раствором макро солей по МС в разбавленном в 3 раза. После набора необходимой массы из данных растений выделяли экстракт и анализировали

2.2.4. Предварительная пробоподготовка растительного материала с

помощью ручной гомогенизации образца

1) Подготовить исследуемый материал, с помощью пинцета извлечь его из пробирки и поместить на стерильную фольгу для последующего взвешивания. Пинцет находится в фарфоровом стакане в 70% спирте и вносится в пламя спиртовки при каждой манипуляции. Для идентификации вирусной инфекции используется от 60-200 мг образца.

2) Переместить исследуемый растительный материал при помощи пинцета в стерильную ступку.

3) Добавить в стерильную ступку 1 мл экстрагирующего буфера и стерильного стеклянного песка на кончике скальпеля. Гомогенизировать необходимое количество растительного образца в стерильной ступке с пестиком, до получения однородной массы.

4)Добавить еще 2 мл экстрагирующего буфера в ступку ч гомогенным образцом и повторно растереть образцы.

5)Перенести 1 мл гомогенного образца из ступки в 1,5 мл микроцентрифужную пробирку и инкубировать 5 минут при комнатной температуре периодически перемешивая на микроцентрифуге-встрехивателе.

6)Центрифугировать 5000 об/мин 5 минут. Этап пробоподготовки образца завершен.