«Разработка метода микроклонального размножения растений Dendrobiumnobile 'White'»

Специализированная морфология, структура и физиологические свойства орхидных всегда очаровывали ботаников, садоводов и биологов- эволюционистов, а красота и таинственность, окружающая эти декоративные драгоценности, всегда привлекали внимание как любителей, так и ученых. Орхидные образуют чрезвычайно своеобразную группу растений из-за их узкоспециализированной системы опыления, маленьких, тонких и неэндоспермных семян, обязательных требований микоризной ассоциации во время прорастания, разнообразных и космополитических местообитаний, передовых эвотенденции развития, экстраординарные механизмы адаптации и устойчивости в неблагоприятных условиях окружающей среды (Yagame et al., 2012). Тем не менее, быстрый и динамичный прогресс в молекулярной биологии и биотехнологии помогли создать новые сорта с такими характеристиками, как разноцветные цветы, устойчивость к болезням и вредителям, и позволили определить происхождение и Dendrobium за растущего спроса и популярности орхидных в настоящее время это многомиллионный бизнес, главным образом, в виде горшечных растений и срезанных стеблей (Winkelmann et al., 2006). Для удовлетворения спроса на орхидные в будущем, а также для сохранения их биоразнообразия, разработка и внедрение новых технологий очень важны для улучшения качества мощности, устойчивости к биотическим и абиотическим стрессам и быстрого массового размножения представителей этого типа. В последнее время орхидные стали центром внимания новых областей исследований растений, включая генную инженерию, функциональную геномику, протеомику и метаболомику (Chang et al., 2011), все из которых требуют передовых трансгенных стратегий (Тейшейра да Силва и др., 2011) для достижения своих различных целей.

У любителей цветов чаще всего можно встретить большое разнообразие представителей рода Дендробиум Нобиль, в связи с его несложным уходом в домашних условиях, поэтому актуально установить связь между составом питательных сред, биотехнологией размножения орхидных и быстрым получением растений-регенерантов, что позволит в короткие сроки получить массовый посадочный материал.

Целью работы являлось определение перспективности стеблевых узлов для массового размножения дендробиума.

В задачи исследования входило:

1. определение оптимальных условий для введения стеблевых узлов Дендробиума 

максимального коэффициента мультипликации.

Научная новизна работы.

Проведено изучение микроклонального размножения Dendrobium nobile 'White'c учетом их биологических особенностей. Дано обоснование и показана целесообразность двухэтапного введения в культуру при использовании питательной среды для моноподиальных орхидей, а затем среды на основе комплексного минерального раствора Fertika Люкс, что позволяет добиться высокого коэффициента размножения и мультипликации. Методы культивирования тканей, разработанные в ходе эксперимента, являются эффективным решением для массового размножения D. nobile за короткий промежуток времени.

Создание надежной методологии клонирования для этой орхидеи важно с точки зрения обеспечения быстрого размножения и производства большого количества высококачественных растений. Таким образом, настоящее исследование было разработано для установления протокола пролиферации побегов in vitro и укоренения орхидеи Dendrobium nobile 'White'. Подбор питательной среды для обширного микроклонального размножения дорогостоящих сортов дендробиума послужит основой для распространения в промышленных масштабах.

Практическое значение.

Полученные результаты генетического исследования позволяют рекомендовать технологию микроклонального размножения Dendrobium nobile 'White' по пути формирования адвентивных почек через стеблевые узлы, как эффективную методику для масштабного производства данного сорта растения.

Апробация.

Работа выполнялась в лаборатории биотехнологии и генетики растений на базе Южно-Уральского ботанического сада-института УФИЦ РАН.

Продуктами выпускной квалификационной работы являются статьи, опубликованные в сборнике «Вавиловские чтения-2018» посвященный 131- летию со дня рождения академика Н.И.Вавилова: «Начальные этапы размножения Dendrobium nobile 'White' в культуре in vitro», «Молекулярно-генетические исследования генетической стабильности растений- регенерантов».

При разработке метода микроклонального размножения растений нами были проведены следующие этапы:

1) Выбор растения-донора;

2) Стерилизация согласно общепринятым методикам (Бутенко, 1964; Калинин и др. 1980; Катаева и др., 1983);

3) Собственно микроклональное размножение;

4) Наблюдение и анализ полученных вследствие размножения растений- регенерантов;

5) Исследование влияния минеральных и органических подкормок на интенсивность роста и развития молодых растений.

2.1.2. Стерилизация лабораторного оборудования

Вся посуда, предназначенная для приготовления, хранения питательных сред и выращивания растительного материала, подвергается тщательной мойке.

1. Обработка мыльным раствором в течении 15 минут;

2. Промывка сильной струей тепло воды на протяжении 5 минут;

3. Двукратное ополаскивание дистиллированной водой;

4. После мытья посуду высушивают в сушильном шкафу при 100- 130оС;

5. Закрывают ватными пробками или целлофановыми колпачками;

6. Дальнейшее хранение в контейнерах или шкафах, защищенных от попадания пыли.

Стерилизация ламинар-бокса. Ламинар-боксы предназначены для культуры изолированных клеток, тканей и некоторых других работ, требующих стерильности. Стерильность обеспечивается с помощью бактериальных фильтров, установленных в ламинар - боксе, через которые нагнетается воздух. За 2 часа до начала работы ламинар - бокс облучают бактерицидными ультрафиолетовыми лампами. Предварительно в ламинаре размещают спиртовую горелку, спички, емкости с 96%-ным спиртом и стерильной водой, а также прочее необходимое оборудование. Внутреннюю поверхность ламинара и внешние поверхности всего вносимого в ламинар оборудования протирают 70%-ным спиртом. Перед работой в ламинар - боксе необходимо вымыть руки с мылом и протереть их спиртом

Фламбирование (прокаливание) - стерилизация над пламенем спиртовки или горелки. Этим методом обычно стерилизуют металлические предеты: пинцеты, бактериологические петли, ножницы, скальпель и др. (Маннапова, 2018).

Непосредственно перед работой и в её процессе инструменты (пинцеты, скальпели, иглы) еще раз стерилизуют в ламинар-боксе, помещая их в фарфоровый стакан с 96%-ным этиловым спиртом и обжигая в пламени горелки. Стерильный инструмент используют только для одной манипуляции. Очень тонкие инструменты (иглы, лезвия и т.п.) могут терять свои свойства при обжигании, поэтому их стерилизуют, погружая в спирт (Калинин, 1992).

Предварительная стерилизация инструментов (скальпелей, пинцетов, игл и т.д.) заключается в нагревании сухим горячим жаром в сушильном шкафу в течение 2 часов при температуре 140оС (Черевченко, 2008).

Стерилизация сухим жаром в печах Пастера. Печь Пастера - двухстенчатый сушильный шкаф. В печах Пастера стерилизуют стеклянную посуду, пробирки, чашки Петри, шприцы, металлические инструменты, обернутые для последующего сохранения стерильности до применения в работе. Нельзя стерилизовать сухим жаром воспламеняющиеся вещества, питательные среды, воду, резиновые предметы (Маннапова, 2018).