«Оптимизация методов количественной оценки антибиотической и антигрибной активности микробных хитиназ и хитозаназ» - Дипломная работа

Содержание

ВВЕДЕНИЕ 4

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8

1.1. Современная классификация и структурно-функциональное разнообразие хитинолитических ферментов 8

1.2. Функциональные характеристики и биологическая роль хитинолитических ферментов 17

1.3. Аспекты биотехнологического применения хитиназ и хитозаназ 27

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 33

2.1. Культуры микроорганизмов 33

2.2. Условия поддержания и культивирования штаммов бактерий и микромицетов 33

1.1. Оценка антагонистической активности хитинолитических культур бактерий 34

1.2. Определение ферментативной активности хитинолитических штаммов бактерий 35

2.5. Получение коллоидного хитина и хитозана 36

2.6. Методы очистки хитинолитических ферментов 37

2.6.1. Ультрафильтрация 37

2.6.2. Аффинная сорбция на коллоидном хитине/хитозане 37

2.6.3. Хроматографические методы 37

2.7. Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле 38

2.8. Т онкослойная хроматография 38

2.9. Характеристика хитиназ 39

2.10. Анализ фунгицидной активности хитиназ 40

2.11. Определение концентрации белка 41

2.12. Световая микроскопия 41

2.13. Статистическая обработка результатов 42

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 43

3.1. Особенности продукции хитинолитических ферментов штаммами родов Bacillus и Paenibacillus 43

3.2. Сравнительная оценка антагонистической активности штаммов бактерий, различающихся по способности и уровню синтеза хитинолитических ферментов 55

3.3. Особенности очистки и свойства хитинолитических ферментов штаммов Bacillus и Paenibacillus 58

3.4. Рост-ингибирующая активность очищенных хитиназ и способы ее оценки 64

3.5. Микрообъемный спектрофотометрический анализ как подход для экспресс-оценки фунгцидной активности очищенных хитиназ/хитозаназ 68

ГЛАВА 4. МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ПРИМЕНЕНИЮ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО МАТЕРИАЛА ВЫПУСКНОЙ КВАЛИФИКАЦИОННОЙ РАБОТЫ В ШКОЛЬНОМ КУРСЕ

БИОЛОГИИ 72

4.1. Роль биологического образования в школе 72

4.2. Анализ тематического планирования по разделам учебников биологии 73

4.3. Разработка урока на тему «Роль бактерий в природе и жизни человека», 7 класс 75

4.4. Использование логико-смысловой модели в процессе биологического образования 77

ВЫВОДЫ 79

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 80

Введение

Хитинолитические ферменты играют важную роль в глобальном круговороте хитина - второго после целлюлозы по распространенности в природе структурного полисахарида. Хитин является основным строительным полимером экзоскелета всех членистоногих животных, он входит в состав покровов, клеточных стенок и внутренних структур огромного количества гидробионтов (моллюсков, губок, диатомей, некоторых одноклеточных зеленых водорослей и т.д.). Ежегодный синтез хитина в мировом океане оценивается в 1010-1011 т [10]. Кроме того, хитин представлен в качестве основного компонента клеточной стенки большинства высших грибов. Основная проблематика исследований хитина связана с необходимостью экологически безопасной утилизации большого объема хитин-содержащих отходов переработки морепродуктов и биотехнологического применения хитина и его производных. В настоящее время промышленное применение хитина сильно ограничено по сравнению с целлюлозой. Основным масштабным направлением конверсии природного хитина является получение его деацетилированного производного - хитозана, применяемого в самых различных отраслях промышленности, медицины, фармакологии, сельского хозяйства и др. Однако, получение хитозана сопряжено с широким использованием агрессивных реагентов и образованием отходов, загрязняющих окружающую среду. Один из экологически сбалансированных подходов биотехнологической

трансформации хитина в соединения с высокой добавленной стоимостью может быть основан на применении различных групп хитинолитических ферментов. Хитиназы распространены повсеместно практически у всех групп организмов, начиная с вирусов и заканчивая человеком. Биологическая роль этих ферментов довольно хорошо изучена, но, в то же время остается не всегда ясной в отношении отдельных организмов. Обширную группу ферментов составляют хитозаназы, участвующие в расщеплении хитозана и косвенным образом вовлеченные в пути естественной биодеградации хитина. Несмотря на интенсивные исследования этих ферментов в последние десятилетия, их роль в конверсии хитина, а также в антагонистических межмикробных взаимодействиях остается невыясненной.

Ключевые вопросы биотехнологической перспективности хитиназ остаются сфокусированы на таких аспектах, как разработка эффективных и экологически безопасных биологических средств защиты растений от фитопатогенов и вредителей, создание новых биофунгицидов для областей медицины и ветеринарии, разработка энзиматических технологий получения водорастворимых биологически активных хитоолигосахаридов из хитина и хитозана, переработка и конверсия хитин-содержащего сырья из отходов переработки морепродуктов (крабы, креветки, криль и т.д.), одомашненных и разводимых насекомых (пчелиный подмор, личинки тутового шелкопряда, черная львинка, мясная муха и др.), отходов мицелия грибов, используемых в биотехнологической промышленности (Aspergillus niger, Penicillium и др.), грибных блоков, используемых для выращивания съедобных грибов. Кроме того, оценка экологической роли микробных хитиназ/хитозаназ, их значимость в глобальных и локальных процессах биодеградации хитина, участие в межмикробных взаимоотношениях, а также в системах микробиом - организм-хозяин, является важной составляющей фундаментальных исследований этих ферментов.

Хитинолитические ферменты являются одной из наиболее изученных групп белков с противогрибковой активностью, используемых в генноинженерных работах для повышения устойчивости сельскохозяйственных растений к фитопатогенным грибам. Непосредственное использование хитинолитических бактерий и грибов в составе биопрепаратов для защиты растений, также может быть эффективным инструментом в биоконтроле насекомых-вредителей, переносчиков болезней и паразитов. Однако не все хитиназы и хитозаназы обладают выраженной антигрибной активностью. Имеется также различие в активности и специализации хитиназ семейств гликозил-гидролаз 18 и 19. Для характеристики антигрибных свойств хитинолитических ферментов необходима адекватная оценка их рост- ингибирующей активности, которая требует проведения более детального анализа соответствующей методологии. В настоящее время в большинстве исследований для определения противогрибковой активности хитиназ/хитозаназ используется классический метод диффузии в агар (по аналогии с оценкой активности антибиотиков). Не всегда принимается во внимание возможность наложения эффекта примесных соединений в препаратах ферментов и влияние антибиотиков, образуемых одновременно бактериями-антагонистами.

Целью данной работы является оценка существующих методологических подходов в сравнительной характеристике противогрибковой активности хитинолитических ферментов различных представителей эндоспорообразующих бактерий и микромицетов. Для реализации цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить особенности синтеза хитинолитических ферментов штаммами антагонистическими и неантагонистическими штаммами бактерий и микромицетов;

2. Оценить in vitro антигрибную активность штаммов бактерий, различающихся по уровню синтеза хитинолитических ферментов;

3. Охарактеризовать свойства и наиболее эффективные методы выделения и очистки хитинолитических ферментов исследуемых штаммов бактерий и микромицетов;

4. Оценить in vitro рост-ингибирующую (фунгистатическую) активность частично очищенных препаратов хитиназ/хитозаназ на основе существующих методов;

5. Изучить фунгицидную/фунгистатическую активность очищенных хитиназ и хитозаназ с помощью микрообъемного планшетного анализа.

6. Разработать методические рекомендации по использованию теоретического и экспериментального материала в школьном курсе биологии.

Научная новизна. Будут изучены функциональные особенности хитиназ, синтезируемых различными представителями аэробных спорообразующих бактерий и уточнена их роль в проявлении антагонистической активности исследуемых штаммов к фитопатогенным грибам.

Практическая значимость. Будут апробированы экономичные и быстрые методы количественного учета антигрибной активности хитинолитических ферментов, что позволит упростить в дальнейшем процедуры скрининга антигрибных белков и пептидов по их целевым характеристикам. Результаты изучения особенностей биосинтеза хитинолитических ферментов различными штаммами бактерий и микромицетов могут быть использованы в дальнейшем для оптимизации процессов синтеза хитиназ/хитозаназ в лабораторном/полупромышленном масштабе с использованием методов экспериментального планирования.

Апробация. По материалам данной выпускной квалификационной работы подготовлена и опубликована статья Л.Г. Нуриева, Г.Э. Актуганов. Свойства и применение хитинолитических ферментов//Труды Межвузовской научной конференции молодых ученых «Вавиловские чтения - 2018, 28 ноября». - Уфа: Изд-во БГПУ, 2018.-С.50-54

Работа выполнена в лаборатории прикладной микробиологии Института биологии УНЦ РАН. Выражаю искреннюю благодарность своему научному руководителю Актуганову Г.Э. за оказание практической помощи при выполнении выпускной квалификационной работы, а также Абрамову С.Н. за предоставленную мне возможность работать в данном научном направлении.

Выдержка из текста работы

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Современная классификация и структурно-функциональное разнообразие хитинолитических ферментов

Наиболее известна классификация ферментов, рекомендованная Комитетом по номенклатуре Международного Союза биохимии и молекулярной биологии (IUBMB) в соответствии с типом катализируемой ферментом реакции (IUBMB ExplorEnz Enzyme database, https://www.brenda- enzymes.org). Основы номенклатуры хитинолитических ферментов были заложены в 1961 г., с включением в их перечень хитиназы (КФ 3.2.1.14), хитобиазы (КФ 3.2.1.29) и e—N—ацетил—глюкозаминидазы (КФ 3.2.1.30). Хитиназа была определена как фермент эндо-типа, случайным образом расщепляющий внутренние гликозидные связи в молекуле хитина, тогда как остальные два фермента являлись экзо-гликозидазами, катализирующими окончательный гидролиз молекулы дисахарида - хитобиозы до конечного мономера (№ацетил-О-глюкозамин), либо последовательно отщепляющими мономерные звенья с нередуцирующего конца высших олигомеров хитина. В 1992 г. позиции обоих ферментов были объединены с предложенным в 1972 г. ферментом e—N—ацетил-глюкозаминидазой под общим шифром 3.2.1.52, в эту группу были включены ферменты, гидролизующие с нередуцирующего конца как N-ацетилглюкозиды, так и N-ацетилгалактозиды. С углублением изучения микробных хитиназ, к 1990-м гг. стало известно о широкой распространенности другого типа экзо-хитиназ, катализирующих последовательное отщепление димера с нередуцирующего конца молекулы хитина. В 2017 г. в номенклатуру хитинолитических ферментов были включены новые типы экзо-хитиназ под шифрами КФ 3.2.1.200 и КФ 3.2.1.201, а также эндо-хитодекстриназы (КФ 3.2.1.202). Основные отличия заключаются в ориентации и движении молекул этих ферментов в процессе деградации хитина. Хитиназа ChiB (КФ 3.2.1.200) осуществляет отщепление диацетилхитобиозы с нередуцирующего конца, а хитиназа ChiA (КФ

3.2.1.201) - с редуцирующего конца молекулы хитина, при этом оба

фермента движутся во взаимно противоположных направлениях (рис. 1.1).

Рис. 1.1. . Схема ферментативного расщепления хитина бактериями на примере Serratia marcescens [94]. В деградации хитина участвуют различные типы экзо-хитиназ (ChiA и ChiB), эндо-хитиназ (ChiC), ферменты, расщепляющие малые молекулы димеров и олигомеров (хитобиаза) и некаталитические хитин-связывающие белки (CPB21).

Оба фермента (наряду с хитиназой ChiC) входят в систему деградации хитина Serratia marcescens и близких групп бактерий (рис. 1.1).

В отличие от других хитиназ, хитодекстриназа (КФ 3.2.1.202) не способна гидролизовать хитин, а действует только на его олигомеры со степенью полимеризации (СП) от 4 и выше с образованием в качестве основного продукта диацетилхитобиозы и небольших количеств триацетилхитотриозы. Для хитодекстриназы характерен эндо-механизм действия, и она была впервые описана как периплазматический фермент, вовлеченный в катаболитный путь расщепления хитина у представителей семейства Vibrionaceae, являющих преимущественно водными и морскими обитателями [9, 41].

Помимо собственно хитиназ, к хитинолитическим ферментам относят также хитозаназы - ферменты, катализирующие гидролиз хитозана -

деацетилированного производного хитина, состоящего преимущественно из остатков D-глюкозамина, соединенных в-1,4-гликозидными связями. В природе хитозан встречается значительно реже хитина и обнаруживается в основном в составе клеточных стенок мукоровых грибов и других представителей отдела Zygomycota [84, 105]. Основными ферментами,

включенными в перечень номенклатуры, являются хитозаназа (КФ 3.2.1.132) и экзо-1,4-в-О-глюкозаминидаза (КФ 3.2.1.165). Оба фермента активно гидролизуют хитозан, при этом хитозаназа осуществляет деполимеризацию субстрата по эндо-механизму, тогда как для действия экзо-1,4-Р-О- глюкозаминидазы характерно последовательное отщепление мономерных звеньев D-глюкозамина с нередуцирующего конца молекулы хитозана. Наименьшим продуктом действия хитозаназы является димер, хитобиоза, наряду с высшими олигомерами (n=2-6 и более), при действии экзо- хитозаназы образуется исключительно D-глюкозамин. Недавно Seki с соавт. (2019) выявили новый тип экзо-хитозаназы из гриба Gongronella butleri, названный ими экзо-хитобиогидролазой, освобождающей димеры с нередуцирующего конца молекул хитозана [71].

Заключение

1. Исследованы физико-химические параметры продукции хитинолитических ферментов исследуемыми штаммами бактерий и грибов. Установлен индуцибельный характер синтеза хитиназ штаммами родов Bacillus, Paenibacillus и Cohnella. Выявлены специфические отличия в синтезе хитиназ штаммом Paenibacillus ehimensis по сравнению с другими штаммами в присутствии хитина грибного происхождения.

2. Установлено, что хитиназная и хитозаназная активность исследуемых штаммов не коррелируют с их антагонистической активностью. Проявление фунгицидной активности хитиназными комплексами преимущественно антагонистических штаммов показывает, что подавление роста грибов, по всей видимости, связано с присутствием в препаратах хитиназ соединений антибиотической природы.

3. Установлены значительные различия хитиназ исследуемых штаммов бактерий и грибов в субстратной специфичности, кинетических параметрах, продуктах деградации хитина/хитозана, оптимуме рН и температуры и оптимальных способах их очистки.

4. Методом диффузии в агар показана более высокая фунгистатическая активность хитиназ, продуцируемых антагонистическими штаммами бацилл, по сравнению с хитиназами неантагонистических культур.

5. Показано, что микрообъемный спектрофотометрический анализ роста микромицетов является информативным подходом для точной экспресс-оценки уровня фунгистатической активности хитиназ.

6. Разработаны методические рекомендации по использованию теоретического и экспериментального материала в школьном курсе биологии.

Список литературы

1. Алимова Ф.К. Промышленное применение грибов рода Trichoderma. Казань: Изд-во КГУ, 2006. - 209 с.

2. Журавлева Н.В., Лукьянов П.А. Хитинолитические ферменты: источники, характеристика и применение в биотехнологии // Вестник ДВО РАН. - 2004. - Вып. 3. - С. 76-86.

3. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник

биохимика. - М.: Мир, 1991. - 544 с.

4. Егоров Н.С. Микробы-антагонисты и биологические методы

определения антибиотической активности. М.: Высшая школа, 1965. - 211 с.

5. Aam B, Heggset E, Norberg A, Sortie M, Varum K, Ejsink V. Production of chitooligosaccharides and their potential application in medicine. Review // Mar. Drugs. - 2010. - V. 8. - P. 1482-1517.

+ еще 101 источник

Примечания

Оригинал в pdf