«Оптимизация методов количественной оценки антибиотической и антигрибной активности микробных хитиназ и хитозаназ»

трансформации хитина в соединения с высокой добавленной стоимостью может быть основан на применении различных групп хитинолитических ферментов. Хитиназы распространены повсеместно практически у всех групп организмов, начиная с вирусов и заканчивая человеком. Биологическая роль этих ферментов довольно хорошо изучена, но, в то же время остается не всегда ясной в отношении отдельных организмов. Обширную группу ферментов составляют хитозаназы, участвующие в расщеплении хитозана и косвенным образом вовлеченные в пути естественной биодеградации хитина. Несмотря на интенсивные исследования этих ферментов в последние десятилетия, их роль в конверсии хитина, а также в антагонистических межмикробных взаимодействиях остается невыясненной.

Ключевые вопросы биотехнологической перспективности хитиназ остаются сфокусированы на таких аспектах, как разработка эффективных и экологически безопасных биологических средств защиты растений от фитопатогенов и вредителей, создание новых биофунгицидов для областей медицины и ветеринарии, разработка энзиматических технологий получения водорастворимых биологически активных хитоолигосахаридов из хитина и хитозана, переработка и конверсия хитин-содержащего сырья из отходов переработки морепродуктов (крабы, креветки, криль и т.д.), одомашненных и разводимых насекомых (пчелиный подмор, личинки тутового шелкопряда, черная львинка, мясная муха и др.), отходов мицелия грибов, используемых в биотехнологической промышленности (Aspergillus niger, Penicillium и др.), грибных блоков, используемых для выращивания съедобных грибов. Кроме того, оценка экологической роли микробных хитиназ/хитозаназ, их значимость в глобальных и локальных процессах биодеградации хитина, участие в межмикробных взаимоотношениях, а также в системах микробиом - организм-хозяин, является важной составляющей фундаментальных исследований этих ферментов.

Хитинолитические ферменты являются одной из наиболее изученных групп белков с противогрибковой активностью, используемых в генноинженерных работах для повышения устойчивости сельскохозяйственных растений к фитопатогенным грибам. Непосредственное использование хитинолитических бактерий и грибов в составе биопрепаратов для защиты растений, также может быть эффективным инструментом в биоконтроле насекомых-вредителей, переносчиков болезней и паразитов. Однако не все хитиназы и хитозаназы обладают выраженной антигрибной активностью. Имеется также различие в активности и специализации хитиназ семейств гликозил-гидролаз 18 и 19. Для характеристики антигрибных свойств хитинолитических ферментов необходима адекватная оценка их рост- ингибирующей активности, которая требует проведения более детального анализа соответствующей методологии. В настоящее время в большинстве исследований для определения противогрибковой активности хитиназ/хитозаназ используется классический метод диффузии в агар (по аналогии с оценкой активности антибиотиков). Не всегда принимается во внимание возможность наложения эффекта примесных соединений в препаратах ферментов и влияние антибиотиков, образуемых одновременно бактериями-антагонистами.

Целью данной работы является оценка существующих методологических подходов в сравнительной характеристике противогрибковой активности хитинолитических ферментов различных представителей эндоспорообразующих бактерий и микромицетов. Для реализации цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить особенности синтеза хитинолитических ферментов штаммами антагонистическими и неантагонистическими штаммами бактерий и микромицетов;

2. Оценить in vitro антигрибную активность штаммов бактерий, различающихся по уровню синтеза хитинолитических ферментов;

3. Охарактеризовать свойства и наиболее эффективные методы выделения и очистки хитинолитических ферментов исследуемых штаммов бактерий и микромицетов;

4. Оценить in vitro рост-ингибирующую (фунгистатическую) активность частично очищенных препаратов хитиназ/хитозаназ на основе существующих методов;

5. Изучить фунгицидную/фунгистатическую активность очищенных хитиназ и хитозаназ с помощью микрообъемного планшетного анализа.

6. Разработать методические рекомендации по использованию теоретического и экспериментального материала в школьном курсе биологии.

Научная новизна. Будут изучены функциональные особенности хитиназ, синтезируемых различными представителями аэробных спорообразующих бактерий и уточнена их роль в проявлении антагонистической активности исследуемых штаммов к фитопатогенным грибам.

Практическая значимость. Будут апробированы экономичные и быстрые методы количественного учета антигрибной активности хитинолитических ферментов, что позволит упростить в дальнейшем процедуры скрининга антигрибных белков и пептидов по их целевым характеристикам. Результаты изучения особенностей биосинтеза хитинолитических ферментов различными штаммами бактерий и микромицетов могут быть использованы в дальнейшем для оптимизации процессов синтеза хитиназ/хитозаназ в лабораторном/полупромышленном масштабе с использованием методов экспериментального планирования.

Апробация. По материалам данной выпускной квалификационной работы подготовлена и опубликована статья Л.Г. Нуриева, Г.Э. Актуганов. Свойства и применение хитинолитических ферментов//Труды Межвузовской научной конференции молодых ученых «Вавиловские чтения - 2018, 28 ноября». - Уфа: Изд-во БГПУ, 2018.-С.50-54

Работа выполнена в лаборатории прикладной микробиологии Института биологии УНЦ РАН. Выражаю искреннюю благодарность своему научному руководителю Актуганову Г.Э. за оказание практической помощи при выполнении выпускной квалификационной работы, а также Абрамову С.Н. за предоставленную мне возможность работать в данном научном направлении.

3.2.1.201) - с редуцирующего конца молекулы хитина, при этом оба

фермента движутся во взаимно противоположных направлениях (рис. 1.1).

Рис. 1.1. . Схема ферментативного расщепления хитина бактериями на примере Serratia marcescens [94]. В деградации хитина участвуют различные типы экзо-хитиназ (ChiA и ChiB), эндо-хитиназ (ChiC), ферменты, расщепляющие малые молекулы димеров и олигомеров (хитобиаза) и некаталитические хитин-связывающие белки (CPB21).

Оба фермента (наряду с хитиназой ChiC) входят в систему деградации хитина Serratia marcescens и близких групп бактерий (рис. 1.1).

В отличие от других хитиназ, хитодекстриназа (КФ 3.2.1.202) не способна гидролизовать хитин, а действует только на его олигомеры со степенью полимеризации (СП) от 4 и выше с образованием в качестве основного продукта диацетилхитобиозы и небольших количеств триацетилхитотриозы. Для хитодекстриназы характерен эндо-механизм действия, и она была впервые описана как периплазматический фермент, вовлеченный в катаболитный путь расщепления хитина у представителей семейства Vibrionaceae, являющих преимущественно водными и морскими обитателями [9, 41].

Помимо собственно хитиназ, к хитинолитическим ферментам относят также хитозаназы - ферменты, катализирующие гидролиз хитозана -

деацетилированного производного хитина, состоящего преимущественно из остатков D-глюкозамина, соединенных в-1,4-гликозидными связями. В природе хитозан встречается значительно реже хитина и обнаруживается в основном в составе клеточных стенок мукоровых грибов и других представителей отдела Zygomycota [84, 105]. Основными ферментами,

включенными в перечень номенклатуры, являются хитозаназа (КФ 3.2.1.132) и экзо-1,4-в-О-глюкозаминидаза (КФ 3.2.1.165). Оба фермента активно гидролизуют хитозан, при этом хитозаназа осуществляет деполимеризацию субстрата по эндо-механизму, тогда как для действия экзо-1,4-Р-О- глюкозаминидазы характерно последовательное отщепление мономерных звеньев D-глюкозамина с нередуцирующего конца молекулы хитозана. Наименьшим продуктом действия хитозаназы является димер, хитобиоза, наряду с высшими олигомерами (n=2-6 и более), при действии экзо- хитозаназы образуется исключительно D-глюкозамин. Недавно Seki с соавт. (2019) выявили новый тип экзо-хитозаназы из гриба Gongronella butleri, названный ими экзо-хитобиогидролазой, освобождающей димеры с нередуцирующего конца молекул хитозана [71].

3. Установлены значительные различия хитиназ исследуемых штаммов бактерий и грибов в субстратной специфичности, кинетических параметрах, продуктах деградации хитина/хитозана, оптимуме рН и температуры и оптимальных способах их очистки.

4. Методом диффузии в агар показана более высокая фунгистатическая активность хитиназ, продуцируемых антагонистическими штаммами бацилл, по сравнению с хитиназами неантагонистических культур.

5. Показано, что микрообъемный спектрофотометрический анализ роста микромицетов является информативным подходом для точной экспресс-оценки уровня фунгистатической активности хитиназ.

6. Разработаны методические рекомендации по использованию теоретического и экспериментального материала в школьном курсе биологии.

+ еще 101 источник