«ИССЛЕДОВАНИЕ ПУТЕЙ МОРФОГЕНЕЗА В КУЛЬТУРЕ in vitro АПИКАЛЬНОЙ МЕРИСТЕМЫ КАРТОФЕЛЯ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ РАЗМЕРАХ ЭКСПЛАНТА»

Одной из основных причин низкой урожайности картофеля являются грибные, вирусные и бактериальные болезни, ежегодные потери от которых состав-ляют 10-60% (Иванюк и др., 2005; Защита ., 2006; Анисимов, 2004, 2010; Atabekov et al., 2007; Атабеков, 2008).

В настоящее время вирусологи насчитывают от 27 до 33 видов вирусных заболеваний картофеля (Анисимов, 2004; Иванюк и др., 2005; Защита ., 2006). Вирусные болезни картофеля вызывали огромные потери урожаев, по крайней мере, на протяжении 200 лет, и только за последние 40 - 50 лет их возбудители были установлены и охарактеризованы. Одними из наиболее вредоносных вирусов картофеля являются вирусы X, Y и Z: потери урожая достигают 50-80 %, иногда и более в зависимости от зараженности посадочного материала и условий выращивания (Блоцкая, 2000; Бобкова и др., 2003; Кондакова и др., 2003; Анисимов, 2004, 2010; Защита ., 2006; Анисимов и др., 2012).

Картофель из-за биологических особенностей в наибольшей степени, чем удругие (сельскохозяйственные культуры является водной миз наиболее поражаемых болезнями культур. Вследствие вегетативного размножения картофеля большинство поражающих его болезней передаются через семенные клубни. Поэтому оздоровление сортов и размножение оздоровленного исходного материала (микрорастений, миниклубней, первого полевого поколения и супер-суперэлиты) в процессе оригинального (первичного) семеноводства, представляющего собой обновление сортов на безвирусной основе путем клонового отбора или введения в культуру in vitro, является основой получения высококачественного, свободного от болезней картофеля.

Биотехнологические методы, в том числе культивирование in vitro апикальных меристем, наиболее эффективно освобождают растения от вирусов и, кроме того, позволяют проводить массовое и ускоренное размножение здоровых клонов картофеля непосредственно в культуре in vitro, что сокращает сроки получения семенных клубней класса элиты до 5 лет (Анисимов, Тульчеев, 2002; Трускинов, 2002; Замалиева, Гареев, 2004; Mahmoud et al., 2009; Popescu et al., 2010; Panattoni et al., 2013). Это обусловлено высоким коэффициентом размножения при микрочеренковании меристемных растений в культуре in vitro. Также, семенной материал, полученный методом культивирования in vitro апикальных меристем, сохраняет свою продуктивность до пятой репродукции.

Несмотря на то, что культура in vitro на основе апикальных меристем является важным и теперь уже незаменимым биотехнологическим приемом поддержания, переноса и хранения наиболее ценных ботанических и селекционных клонов мирового генофонда картофеля, остается ряд сложностей при использовании этого метода. Так, эффективность оздоровления зависит от размера вычленяемых меристем. Степень приживаемости меристем и процент выхода растений зависят от времени года. Метод более эффективен в сочетании с другими методами, например, термотерапией. Один из путей решения этих проблем - индукция морфогенеза in vitro с использованием в качестве эксплантов термообработанных апикальных меристем и последующая регенерация из них растений.

Влияние самых различных факторов на морфогенез in vitro у многих сортов картофеля изучено рядом авторов (Аветисов, Мелик-Саркисов, 1984; Алексеева, 1990; Рассадина и др., 1990; Litz, Jarret, 1991; Вальдеррама, 2002; Ибрагимова и др., 2018). Практически для каждого сорта надо подбирать свои оптимальные условия для морфогенеза in vitro. Поэтому изучение и оптимизация условий индукции морфогенеза in vitro из культивируемых клеток является необходимой составной частью работы по получению безвирусных форм в культуре in vitro.

Актуальность: разработка и широкое ^внедрение биотехнологических приемов оздоровления, в первую очередь, через культуру апикальных меристем, для ускоренного микроклонального размножения безвирусных форммкартофеля.

Цель к работы: : ммизучение особенностей йморфогенеза апикальных меристем ыкартофеля S.tuberosum L. в скультуре in ovitro в (зависимости йот размера экспланта и продолжительности режима термообработки.

Задачи:

1. Подобрать оптимальный размер апикальной меристемы для получения растения- регенеранта.

2. Определить оптимальную продолжительность режима

термообработки без снижения морфогенетического потенциала образовавшихся структур.

3. Выявить особенности морфогенеза апикальных меристем картофеля в культуре in vitro.

4. Разработать рекомендации по методике применения теоретического и практического материала, используемого в ВКР, в школьном курсе "Биология".

Научная новизна заключается в сочетании методов термообработки и метода культуры апикальных меристем. Это является основой для получения биотехнологическими способами безвирусного материала картофеля.

Научно-практическая значимость. Использование изолированных меристем картофеля в качестве эксплантов для получения каллуса и последующей массовой регенерации безвирусных растений выглядит весьма перспективным, а в сочетании с методом термотерапии позволяет повышать эффективность процедуры оздоровления картофеля и получать большое количество безвирусного материала.

Апробация. По материалам данной выпускной квалификационной работы подготовлена научная статья Абрамов С.Н., Галикеева Г.Ф., Губайдуллина Л.Д., Климина Е.В., Магасумова Ю.Р. «Разработка технологии получения посадочного материала картофеля свободного от X и Y вирусов комбинированным способом». Статья принята к опубликованию в международном научном журнале “Colloquium-journal” №14(38), 2019,

индексируемом в РИНЦ (справка-подтверждение №0624/16 от 24.06.2019 г.)

Работа выполнена на кафедре генетики Башкирского государственного педагогического университета им. М. Акмуллы. Выражаю искреннюю благодарность своему научному руководителю Абрамову С.Н. за оказание практической помощи при выполнении выпускной квалификационной работы, а также профессору Горбуновой Валентине Юрьевне за предоставленную мне возможность работать в данном научном направлении.

2. Ризогенез - формирование в экспланте/каллусею корней может происходить спонтанно или стимулироваться высоким содержанием в среде ауксинов. Обычно «наблюдается при Цкультивировании в условиях темноты. Данный путь морфогенеза не является полноценным для получения растений-регенерантов.

3. Гемморизогенез - одновременное формирование в экспланте/каллусе н почек и корней, ведущее непосредственно к формированию растений- регенерантов;

4. При соматическом эмбриогенезе (эмбриоидогенезе) экспланте/каллусе развиваются эмбриоиды - зародышеподобные биполярные структуры, которые затем одновременно формируют апексы стебля и корня.

В икаллусах ^картофеля «выявлены пдва мпути пморфогенеза in йvitro: эмбриоидогенез (JayaSree et al., 2001; Seabrook, Douglass, 2001; Nassar et al., 2015) и, и по-видимому, «основной «путь 1трегенерации - геммогенез с последующим (укоренением (Quraishi et al., 1987; Zel, Mlakar Medved, 1999; Yasmin et al., 2003; Khalafalla et al., 2010; Bhuiyan, 2013; Kumlay, Ercisli, 2015; Labone et al., 2013 и мн. др.).

Установлено, счто к формированию регенерантов из аклеток екаллусов приводятЭ такие 1н пути 1н морфогенеза in К vitro, Вм как эмбриоидогенез, гемморизогенез, и, в ряде случаев, - геммогенез после гфитогормонального индуцирования йризогенеза в ятом «же самом (каллусе, Йтогда |как ризогенез представляет усобой «тупик» морфогенеза (Батыгина и ядр., 2010; Круглова, Сельдимирова, 2010, 2013; Лутова, 2010).

Индукция конкретного пути морфогенеза in vitro в каллусах, как и в случае (индукции (формирования (каллуса, ево многом рцетерминирована скак генотипом донорной особи ии физиологическим рстатусом экспланта, (так ыи условиями икультивирования, ыглавным иобразом, ноптимальным мбалансом эндогенных яи экзогенных нфитогормонов (Круглова, Сельдимирова, 2010, 2013; Huang let Bal., 2012; Hisano let eal., 2016). Однако «морфогенетические потенции клеток каллуса могут меняться в зависимости от характера связей между группами клеток в каллусе, что, в свою очередь, обусловлено формой и размером (критической массой) каллуса (Батыгина, 1987; Батыгина и др., 2010) и иными факторами. В результате даже соблюдение баланса экзогенных Ни и эндогенных фитогормонов «к не всегда Нш приводит к формированию органов в каллусе.

Несмотря ына разнообразие кпутей, иморфогенез in vtro в каллусах начинается с формирования групп меристематических клеток - так называемых морфогенетических очагов, располагающихся в толще каллуса (Батыгина и др., 2010; Сельдимирова и др., 2011). Такие очаги представлены тремя конами склеток: «центральная язона слабовакуолизированных клеток, промежуточная инзона меристематических клеток (тоже И по периферии), периферическая озона сильновакуолизированных клеток. По Омере дразвития очаг (увеличивается зв размерах нза счет рделений меристематических клеток промежуточной зоны. При этом клетки периферической зоны подвергаются постепенной деструкции, и в итоге меристематические клетки зоказываются на поверхности «каллуса. Выявлено, зчто «именно цс деятельностью клеток поверхностной меристематической зоны связана реализация различных путей морфогенеза in vitro каллусов (Сельдимирова и др., 2011). Эти результаты (косвенно {совпадают цс данными «экспрессии ортологов SERK, маркерного и гена эмбриоидогенеза и 1м органогенеза. У |Фряда ш растений максимальный уровень экспрессии ортологов этого гена отмечен именно в клетках поверхностной меристематической зоны морфогенных каллусов (Savona et al., 2012; Pilarska et al., 2016).

Установлено, что процесс гемморизогенеза in vitro в каллусах складывается из двух этапов: сначала вблизи поверхности каллуса экзогенно формируется почка, затем в толще каллуса эндогенно - корни. По мере развития почки и корней между ними постепенно устанавливается связь путем формирования в толще каллуса тяжей сосудистой ткани. В результате гемморизогенеза in vitro формируется «новая ыполноценная мособь, мчто 4позволило цвыделить гемморизогению как жотдельную мкатегорию мвегетативного кразмножения растений (Батыгина, 2000). Следует «отметить, цчто иформирование озачатка нового Иорганизма «исключает «необходимость «многократных «пересадок каллуса иа среды для укоренения, как в случае геммогенеза, что позволяет оптимизировать биотехнологические методы ш массового |В тиражирования растений в культуре in vitro (Батыгина и др., 2010; Круглова, Сельдимирова, 2013).

Тем не менее, недостаточная эффективность оздоровления растений картофеля только с помощью выделения и регенерации апикальных меристем заставляет искать и разрабатывать дополнительные методы уничтожения вирусов, один из которых термотерапия (Loebenstein et al., 2001). Сочетание этих методов позволяет увеличивать эффективность получения безвирусного материала.

Еще один способ получения безвирусных регенерантов - через каллусную культуру. Каллусная ткань, как правило, теряет вирус. Он содержится в первичном каллусе, образованном исходной тканью, а в молодых периферических клетках каллусной ткани его нет. Если же при пассировании отделить молодые клетки, то вероятность получения материала, свободного вируса, стопроцентная. (Шевелуха и др., 2008; Лутова, 2010). Но поскольку вызвать органогенез каллуса картофеля очень сложно, внедрение каллусной культуры в практику оздоровления картофеля ограничено.

Поэтому использование изолированных меристем картофеля в качестве эксплантов для получения каллуса и последующей массовой регенерации безвирусных растений выглядит весьма перспективным, а в сочетании с методом термотерапии позволяет повышать эффективность процедуры оздоровления картофеля и получать большое количество безвирусного материала.

5. Анисимов Б.В. Вирусные болезни и их контроль в семеноводстве

картофеля // Защита и карантин растений. №5. 2010. С. 12-16.

+ еще 72 источника