«МОДИФИКАЦИЯ ГЕНОМА РАСТЕНИЙ МЕТОДОМ CRISPR/Cas С ЦЕЛЬЮ ПОЛУЧЕНИЯ СОРТОВ С ВЫСОКИМ СОДЕРЖАНИЕМ АНТОЦИАНОВ» - Дипломная работа

Содержание

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ 4

ВВЕДЕНИЕ 5

ГЛАВА 1. ТЕХНОЛОГИЯ CRISPR/Cas И ПЕРСПЕКТИВЫ СОЗДАНИЯ СОРТОВ С ВЫСОКИМ СОДЕРЖАНИЕМ АНТОЦИАНОВ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ) 9

1.1. Методы направленного редактированиям генома 9

1.2. Технология CRISPR/Cas 14

1.3. Транскрипционный фактор MYB биосинтеза антоцианов 17

1.4. Ген ANT1 18

1.5. Общая характеристика антоцианов 19

1.6. Антиоксидативные свойства антоцианов 23

1.7. Бинарная векторная CRISPR-плазмида pTC223 24

1.8. Методы доставки векторных конструкций 24

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 29

2.1. Материалы исследования 29

2.1.1. Трансформируемые растения 29

2.1.2. Приготовление питательных и селективных сред для культивирования и регенерации трансгенных растений 29

2.1.3. Agrobacterium tumefaciens и A.rhizogenes 32

2.1.4. Плазмида pTC223 32

2.2. Методы исследования 33

2.2.1. Бактериологические методы 33

2.2.2. Генно-инженерные методы 37

2.2.3. Молекулярно-генетические методы 41

2.2.4. Методы изучения антоцианов 46

2.2.5. Биоинформатические методы 49

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 50

3.1. Схема эксперимента 50

3.2. Биоинформатический анализ 50

3.3. Агробактериальная трансформация in vitro 52

3.4. Получение регенерантов 54

3.5. ПЦР-анализ линий бородатых корней 57

3.6. Изменение окраски спиртовых экстрактов антоцианов 58

3.7. Спектрофотометрическое pH-дифференциальное исследование 62

3.8. Агробактериальная трансформация томата in planta 64

3.9. Агробактериальная трансформация рапса (Brassica napus) с использованием pTC223 65

3.10. Планирование эксперимента по модификация pTC223 для трансформации растений из семейства Brassicaceae 67

ГЛАВА 4. МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ РЕЗУЛЬТАТОВ ВЫПУСКНОЙ КВАЛИФИКАЦИОННОЙ РАБОТЫ В ШКОЛЬНОМ КУРСЕ «БИОЛОГИЯ» 70

4.1. Роль и значение биологии в системе школьного образования 70

4.2. Анализ программ и учебников по реализации материалов ВКР в школьном курсе «Биология» основного общего образования 72

4.3. Разработка урока по биологии в 5 классе на тему «Разнообразие, распространение, значение растений» 81

4.4. Использование логико-смыслового моделирования в образовательном процессе 87

ВЫВОДЫ 91

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 93

ПРИЛОЖЕНИЕ 108

Введение

В последнее время наблюдается все ускоряющийся рост населения планеты. Вместе с тем, растет и потребность в продуктах питания, имеющих наилучшую биодоступность и высокое содержание нутриентов. Для этого требуется быстрое создание сортов растений, адаптированных к изменяющимся условиям среды и с резистентностью к новым фитопатогенам (Хлесткина и др., 2016). Существует несколько способов получения растений с ценными для человека признаками.

Вот уже множество столетий человечество проводит селекцию растений на продуктивность и стрессоустойчивость, а также совершенствует технологии возделывания для достижения максимальной плодовитости хозяйственно ценных культур. Совершенствуются и методы селекции. Огромные временные затраты - главный недостаток традиционных методов селекции (массовый и индивидуальный отбор, комбинационная селекция) - в среднем, для выведения нового сорта растения требуется от 7 до 12 лет (Сухарева и др., 2018). Ускорение темпов создания сортов позволяет также сократить посевные селекционные площади и снизить финансовые затраты (Хлесткина и др., 2016). Маркер-опосредованная селекция (Marker-Assisted Selection, MAS) (Азарин и др., 2012) и геномная селекция (Genomic Selection, GS) (Хлесткина, 2013), в основе которых лежит исследование ДНК- маркеров, рассматриваются как наиболее перспективные направления селекции, помогающие не только сократить временные затраты, но и повысить эффективность селекционной работы (Сухарева и др., 2018).

Актуальность проблемы. Помимо селекции существуют более современные и эффективные способы создания новых хозяйственно ценных сортов растений, например, с помощью методов генетической инженерии и геномного редактирования. Эти методы позволяют получить новые генотипы в рамках естественного генетического разнообразия вида (замена аллелей в соответствии с существующими в природе вариантами) или его расширения путем переноса чужеродных генов (Хлесткина и др., 2016).

При создании трансгенных растений, из-за невозможности проведения сайт-направленного встраивания, зачастую имеет место низкая экспрессия встроенного гена (за счет эффекта положения) или полное отсутствие продукта этого гена (сайленсинг) (Хлесткина и др., 2016). К тому же, встраивание чужеродных последовательностей ДНК в структурную или регуляторную область функционально важных генов, может привести к нарушению метаболизма у растения-реципиента (Gelvin, 1998).

В последние десятилетия были разработаны подходы позволяющие проводить направленное изменение и встраивание генов путем внесения сайт-специфических двуцепочечных разрывов ДНК (Хлесткина и др., 2016). В качестве направляющего агента могут выступать как белковые молекулы (мегануклеазы, ZFN, TALEN), так и нуклеиновые кислоты (химерные ДНК- РНК олигонуклеотиды, CRISPR/Cas) (табл. 1).

Целесообразно использовать для выведения новых сортов растений новейшие технологии, такие как CRISPR/Cas, в первую очередь потому, что эта технология позволяет производить сайт-направленное высокоточное редактирование одновременно несколько генов.

Научная новизна исследования. Несмотря на стремительное распространение технологии CRISPR/Cas, её возможности чаще всего используются для целенаправленного удаления участков ДНК, тогда как в представленном исследовании будет осуществлено встраивание донорной ДНК в определенное место растительного генома (нокин).

Цель исследования: разработка методики создания генетически трансформированных растений (прежде всего Brassicaceae) на основе векторной CRISPR-конструкции pTC223 и её дальнейшая модификация для создания сортов, с повышенным содержанием антоциановых пигментов.

Задачи исследования:

1. Проверка CRISPR-плазмиды pTC223 для агробактериальной трансформации томата (Solanum lycopersicum) сорта Micro-Tom, табака (Nicotiana tabacum) сорта Havana линии SR1 дикого типа и рапса (Brassica napus) сортов Риф и Ярило;

2. Трансформация растений при помощи A.tumefaciens штамма AGL0 и A.rhizogenes штаммов А4 и 15834;

3. ПЦР-анализ полученных линий бородатых корней;

4. Экстракция и определение концентрации антоциановых пигментов в полученных линиях бородатых корней методом pH- дифференциальной спектрофотометрии;

5. Поиск генов-мишеней для модификации pTC223 и трансформации растений из семейства капустных (Brassicaceae);

6. Разработка методических рекомендаций по применению материалов ВКР в школьном курсе «Биология».

Практическая значимость. Появление антоциановой окраски различных частей растения может служить визуальным маркерным признаком успешной модификации растительного генома, а также повышает стрессоустойчивость самого растения, его декоративную и пищевую ценность в контексте профилактического питания.

Апробация. По материалам дипломной работы были опубликованы две научные работы в рамках ежегодной конференции «Вавиловские чтения» 2018 г. в БГПУ им. Акмуллы (Сухарева А.С., Михайлова Е.В., Кулуев Б.Р. Роль антоциановых пигментов в растительных и животных организмах// Вавиловские чтения - 2018. - С. 67-76. [РИНЦ]) и международной научной конференции «Растения и микроорганизмы: биотехнология будущего» PLAMIC2018 в ИБГ УФИЦ РАН (Mikhaylova E.V., Kuluev B.R., Sukhareva A.S., Chemeris A.V. Prospects for genome editing in Brassicaceae // Plants and microbes: the future of biotechnology: abstract book International Scientific

Conference PLAMIC2018 (Russia, Ufa, 13-17 June 2018). - Ufa, 2018. - P. 56. ISBN 978-5-6041302-1-6 [http://plamic.ru/sbornik/] [РИНЦ]).

Выпускная квалификационная работа выполнена в лаборатории биоинженерии растений и микроорганизмов Института биохимии и генетики Уфимского федерального исследовательского центра Российской академии наук.

Выдержка из текста работы

1.2. Технология CRISPR/Cas

CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) - расположенные регулярными кластерами короткие палиндромные повторы. Являются особыми локусами геномов бактерий и архей, обеспечивающими им приобретенный иммунитет против бактериофагов. Первые упоминания в научной литературе об обнаружении таких повторов при частичном секвенировании генома Escherichia coli датируются 1987 годом (Ishino et al., 1987). Группа японских ученых обнаружила протяженный некодирующий участок, содержащий повторяющиеся последовательности ДНК перемежающиеся спейсерами - специфичными вариабельными последовательностями. Такой участок позже стали называть CRISPR кассетой (CRISPR cassette или CRISPR array). CRISPR кассеты и гены CRISPR-ассоциированных нуклеаз Cas (CRISPR associated) в виде оперона вместе составляют CRISPR локус в геноме бактерий. Таргетирование определяют спейсеры (spacers), входящие в состав крРНК (crRNA, crispr RNA). Вариабельная часть крРНК связывается со специфичным участком в составе генома вируса или редактируемого генома, называемым протоспейсером (protospacer), т.е. с целевым сайтом (on-target site), но она также может связаться и с неспецифичными последовательностями (off-target sites) в геноме (Кулуев и др., 2017).

Упрощенная схема механизма защиты своих геномов у бактерий и архей состоит из трех стадий: адаптации, транскрипции и интерференции (Кулуев и др., 2017). Первая стадия - адаптация, заключается в формировании спейсера, происходит при проникновении чужеродной ДНК (бактериофага) и последующего встраивания небольшого участка генома фага (протоспейсера) в соответствующий CRISPR локус генома инфицированной клетки. Новый спейсер будет располагаться впереди остальных ранее встроенных аналогичных последовательностей. Важно отметить, что каждая бактериальная клетка встраивает в качестве спейсера разные участки генома одного и того же патогена. Это обусловлено существованием множества пригодных в качестве мишеней последовательностей при последующих инфекциях и несогласованностью действий бактерий и архей. Это несет в себе и защитный механизм, ведь в случае мутации протоспейсерной последовательности у фага появляется возможность обойти иммунную систему клетки-хозяина, если в качестве спейсера эта клетка содержит смутировавший участок ДНК. Тогда как остальные микроорганизмы из этой популяции, захватившие другие немутировавшие участки, все еще будут устойчивы к атаке вируса (Van Houte et al., 2016). На второй стадии происходит транскрипция всего CRISPR локуса и процессинг, в результате которого образуются короткие крРНК. Далее крРНК связывается с транс-активирующей РНК (тракрРНК, tracrRNA, trans-activated CRISPR RNA). На стадии интерференции посредством тракрРНК происходит формирование комплекса крРНК и белка Cas, в котором вариабельный участок крРНК (спейсер) узнает и связывается с протоспейсером, а фермент Cas его разрушает. Обязательным условием распознавания является наличие мотива PAM (Protospacer Adjacent Motif) смежного с протоспейсером на комплементарной цепи (для нуклеаз разного типа может располагаться как с его 5’-, так и с 3’-конца). ДНК бактерии не содержит PAM, что позволяет отличать чужеродные молекулы от собственных. Для системы CRISPR/Cas9 PAM последовательность имеет вид NGG, где N - любой нуклеотид. В присутствие ионов магния Cas9 образует два одноцепочечных разрыва на расстоянии трех нуклеотидов от PAM. Нуклеаза Cas9 имеет два каталитических домена - RuvC и HNH. RuvC вносит одноцепочечный разрыв в целевой участок генома (протоспейсер), а HNH - в участок гомологичный протоспейсеру и связывающийся с крРНК (Кулуев и др., 2017). Репарация образовавшегося двуцепочечного разрыва может происходить двумя способами: за счет негомологичного соединения концов фрагментов ДНК (NHEJ - Non-Homologous End Joining) и путем гомологичной рекомбинации (HDR - Homology Directed Repair). При NHEJ часто возникают инделы (инсерции или делеции) одного или нескольких нуклеотидов, что может привести к сдвигу рамки считывания и нарушению функциональности белка, кодируемого этим участком. Такое нарушение работы какого-либо гена навывают нокаут (knock-out, KO). HDR позволяет осуществить редактирование или вставку в целевой сайт генома фрагмента ДНК несущего желаемый для экспериментатора признак, но для этого необходимо присутствие такого фрагмента в месте действия. Такое внедрение какого-либо гена в геном называют нокин (knock-in, KI). (Кулуев и др., 2017).

Существует большое разнообразие CRISPR/Cas систем. В настоящее время их делят на 2 класса, 6 типов и 19 подтипов (Кулуев и др., 2017). Первый класс CRISPR/Cas систем характеризуется наличием мультисубъединичного комплекса ферментов, называемого Cascade (CRISPR-associated complex for antiviral defence). К этому классу относятся системы I, III и IV типов. Системы второго класса имеют один мультидоменный эффекторный белок и представлены II, V и VI типами.

Наиболее удобной для проведения геномного редактирования оказалась система с эффекторной нуклеазой Cas9 (тип II) и именно она сейчас широко используется (Кулуев и др., 2017). Массовое применение данной системы на практике произошло после того, как было предложено объединить крРНК и тракрРНК в единую направляющую или гидРНК (гидовая РНК, sgRNA, single guided RNA, gRNA) (Jinek et al., 2012). В области геномного редактирования растений первые успешные результаты использования системы CRISPR/Cas9 были опубликованы в 2013 г. (Feng et al., 2013; Li et al., 2013; Nekrasov et al., 2013; Shan et al., 2013; Xie, 2013). При использовании этой технологии ошибочные мутации возникают редко (Xie, 2013) или вовсе не выявляются (Хлесткина и др., 2016). Существенно повысить точность и эффективность модификации помогают тщательный подбор гидРНК (Li et al., 2014) и выбор в качестве мишеней регуляторных

генов, поскольку их изменение чаще всего связано с изменчивостью на фенотипическом уровне (Doebley, 1993; 1998; Хлесткина и др., 2008;

Purugganan, 1998) и такие последовательности имеют более существенный уровень дивергенции, по сравнению со структурными (Purugganan, 1998).

На сегодняшний день существует множество компьютерных программ и баз данных для дизайна экспериментов по CRISPR/Cas и подбору гидРНК с учетом нецелевых сайтов связывания (Чемерис и др., 2017). Также, большое разнообразие плазмид, используемых для CRISPR/Cas редактирования геномов, представлено в репозитории Addgene

Заключение

1. CRISPR-плазмида pTC223 была опробована для трансформации

генома томата (сорта Micro-Tom), табака (сорта Havana линии SR1 дикого типа) и рапса (сортов Риф и Ярило).

2. При помощи A.tumefaciens штамма AGL0 было получено 2 каллусные линии томатов и 10 - табаков in vitro, а также инокулировано in planta 89 цветков и 20 плодов томата.

3. При помощи A.rhizogenes штамма А4 была получена 1 линия

бородатых корней томата и 9 линий табака. При помощи штамма 15834 получено 9 линий бородатых корней томата и 19 линий табака.

4. ПЦР-анализ образцов ДНК из 10 линий бородатых корней

томатов подтвердил событие трансформации в 9 образцах, причем, ни в одном образце не обнаружена контаминация A.rhizogenes.

5. ПЦР-анализ образцов ДНК из 22 линий бородатых корней

табаков подтвердил событие трансформации в 21 образце. Из них, в 5 образцах обнаружена контаминация A.rhizogenes.

6. Методом pH-дифференциальной спектрофотометрии было выявлено наличие антоциановых пигментов в трех линиях бородатых корней табака и определена их массовая концентрация: линия 6 - 91,8443 г/100г; линия 16 - 5,0097 г/100г; линия 15 - 4,1803 г/100г.

7. В геноме растений из семейства Brassicaceae не было обнаружено гомологичных гидРНК из pTC223 последовательностей, следовательно, требуется поиск генов-мишеней (предпочтительно регуляторных областей генома), участвующих в биосинтезе антоцианов для подбора гидРНК. Таковым может стать ген PAP1.

8. Разработан комплекс методических рекомендаций по применению материала данной выпускной квалификационной работы в школьном курсе «Биология» и урок для 5 классов на тему «Разнообразие, распространение, значение растений».

Список литературы

1. Азарин К.В., Маркин Н.В., Лотник B.C. ДНК маркеры в селекции растений: учеб. пособие. Ростов-на-Дону: Издательство Южного

федерального университета., 2012. 16 с.

2. Апарцин Е.К. К.Н.Ю. Методы доставки генетического материала в клетки и возможности их применения в генной терапии // Гены и клетки. 2016. Т. 11. № 2. С. 32-41.

3. Вершинина З.Р., Кулуев Б.Р., Геращенков Г.А., Князев А.В., Чемерис Д.А, Гумерова Г.Р., Баймиев Ал.Х. Ч.А.В. Эволюция методов редактирования геномов // Биомика. 2017. Т. 9. № 3. С. 245-270.

4. ГОСТ 32709-2014. Продукция соковая. Методы определения антоцианинов. Введ. 2016-01-01. М.: Стандартинформ, 2014. 17 с.

5. Дрейпер Дж., Скотт Р. Х.Д. Трансформация клеток двудольных растений с помощью Ti-плазмид Agrobacterium tumefaciens и Ri-плазмид A.rhizogenes // Генная инженерия растений / под ред. R.W. J.Draper, R.Scott, Ph. Armitage. Москва: Мир, 1991. С. 408.

+ еще 139 источников

Примечания

Оригинал в pdf