«МОДИФИКАЦИЯ ГЕНОМА РАСТЕНИЙ МЕТОДОМ CRISPR/Cas С ЦЕЛЬЮ ПОЛУЧЕНИЯ СОРТОВ С ВЫСОКИМ СОДЕРЖАНИЕМ АНТОЦИАНОВ»

Актуальность проблемы. Помимо селекции существуют более современные и эффективные способы создания новых хозяйственно ценных сортов растений, например, с помощью методов генетической инженерии и геномного редактирования. Эти методы позволяют получить новые генотипы в рамках естественного генетического разнообразия вида (замена аллелей в соответствии с существующими в природе вариантами) или его расширения путем переноса чужеродных генов (Хлесткина и др., 2016).

При создании трансгенных растений, из-за невозможности проведения сайт-направленного встраивания, зачастую имеет место низкая экспрессия встроенного гена (за счет эффекта положения) или полное отсутствие продукта этого гена (сайленсинг) (Хлесткина и др., 2016). К тому же, встраивание чужеродных последовательностей ДНК в структурную или регуляторную область функционально важных генов, может привести к нарушению метаболизма у растения-реципиента (Gelvin, 1998).

В последние десятилетия были разработаны подходы позволяющие проводить направленное изменение и встраивание генов путем внесения сайт-специфических двуцепочечных разрывов ДНК (Хлесткина и др., 2016). В качестве направляющего агента могут выступать как белковые молекулы (мегануклеазы, ZFN, TALEN), так и нуклеиновые кислоты (химерные ДНК- РНК олигонуклеотиды, CRISPR/Cas) (табл. 1).

Целесообразно использовать для выведения новых сортов растений новейшие технологии, такие как CRISPR/Cas, в первую очередь потому, что эта технология позволяет производить сайт-направленное высокоточное редактирование одновременно несколько генов.

Научная новизна исследования. Несмотря на стремительное распространение технологии CRISPR/Cas, её возможности чаще всего используются для целенаправленного удаления участков ДНК, тогда как в представленном исследовании будет осуществлено встраивание донорной ДНК в определенное место растительного генома (нокин).

Цель исследования: разработка методики создания генетически трансформированных растений (прежде всего Brassicaceae) на основе векторной CRISPR-конструкции pTC223 и её дальнейшая модификация для создания сортов, с повышенным содержанием антоциановых пигментов.

Задачи исследования:

1. Проверка CRISPR-плазмиды pTC223 для агробактериальной трансформации томата (Solanum lycopersicum) сорта Micro-Tom, табака (Nicotiana tabacum) сорта Havana линии SR1 дикого типа и рапса (Brassica napus) сортов Риф и Ярило;

2. Трансформация растений при помощи A.tumefaciens штамма AGL0 и A.rhizogenes штаммов А4 и 15834;

3. ПЦР-анализ полученных линий бородатых корней;

4. Экстракция и определение концентрации антоциановых пигментов в полученных линиях бородатых корней методом pH- дифференциальной спектрофотометрии;

5. Поиск генов-мишеней для модификации pTC223 и трансформации растений из семейства капустных (Brassicaceae);

6. Разработка методических рекомендаций по применению материалов ВКР в школьном курсе «Биология».

Практическая значимость. Появление антоциановой окраски различных частей растения может служить визуальным маркерным признаком успешной модификации растительного генома, а также повышает стрессоустойчивость самого растения, его декоративную и пищевую ценность в контексте профилактического питания.

Апробация. По материалам дипломной работы были опубликованы две научные работы в рамках ежегодной конференции «Вавиловские чтения» 2018 г. в БГПУ им. Акмуллы (Сухарева А.С., Михайлова Е.В., Кулуев Б.Р. Роль антоциановых пигментов в растительных и животных организмах// Вавиловские чтения - 2018. - С. 67-76. [РИНЦ]) и международной научной конференции «Растения и микроорганизмы: биотехнология будущего» PLAMIC2018 в ИБГ УФИЦ РАН (Mikhaylova E.V., Kuluev B.R., Sukhareva A.S., Chemeris A.V. Prospects for genome editing in Brassicaceae // Plants and microbes: the future of biotechnology: abstract book International Scientific

Conference PLAMIC2018 (Russia, Ufa, 13-17 June 2018). - Ufa, 2018. - P. 56. ISBN 978-5-6041302-1-6 [http://plamic.ru/sbornik/] [РИНЦ]).

Выпускная квалификационная работа выполнена в лаборатории биоинженерии растений и микроорганизмов Института биохимии и генетики Уфимского федерального исследовательского центра Российской академии наук.

Упрощенная схема механизма защиты своих геномов у бактерий и архей состоит из трех стадий: адаптации, транскрипции и интерференции (Кулуев и др., 2017). Первая стадия - адаптация, заключается в формировании спейсера, происходит при проникновении чужеродной ДНК (бактериофага) и последующего встраивания небольшого участка генома фага (протоспейсера) в соответствующий CRISPR локус генома инфицированной клетки. Новый спейсер будет располагаться впереди остальных ранее встроенных аналогичных последовательностей. Важно отметить, что каждая бактериальная клетка встраивает в качестве спейсера разные участки генома одного и того же патогена. Это обусловлено существованием множества пригодных в качестве мишеней последовательностей при последующих инфекциях и несогласованностью действий бактерий и архей. Это несет в себе и защитный механизм, ведь в случае мутации протоспейсерной последовательности у фага появляется возможность обойти иммунную систему клетки-хозяина, если в качестве спейсера эта клетка содержит смутировавший участок ДНК. Тогда как остальные микроорганизмы из этой популяции, захватившие другие немутировавшие участки, все еще будут устойчивы к атаке вируса (Van Houte et al., 2016). На второй стадии происходит транскрипция всего CRISPR локуса и процессинг, в результате которого образуются короткие крРНК. Далее крРНК связывается с транс-активирующей РНК (тракрРНК, tracrRNA, trans-activated CRISPR RNA). На стадии интерференции посредством тракрРНК происходит формирование комплекса крРНК и белка Cas, в котором вариабельный участок крРНК (спейсер) узнает и связывается с протоспейсером, а фермент Cas его разрушает. Обязательным условием распознавания является наличие мотива PAM (Protospacer Adjacent Motif) смежного с протоспейсером на комплементарной цепи (для нуклеаз разного типа может располагаться как с его 5’-, так и с 3’-конца). ДНК бактерии не содержит PAM, что позволяет отличать чужеродные молекулы от собственных. Для системы CRISPR/Cas9 PAM последовательность имеет вид NGG, где N - любой нуклеотид. В присутствие ионов магния Cas9 образует два одноцепочечных разрыва на расстоянии трех нуклеотидов от PAM. Нуклеаза Cas9 имеет два каталитических домена - RuvC и HNH. RuvC вносит одноцепочечный разрыв в целевой участок генома (протоспейсер), а HNH - в участок гомологичный протоспейсеру и связывающийся с крРНК (Кулуев и др., 2017). Репарация образовавшегося двуцепочечного разрыва может происходить двумя способами: за счет негомологичного соединения концов фрагментов ДНК (NHEJ - Non-Homologous End Joining) и путем гомологичной рекомбинации (HDR - Homology Directed Repair). При NHEJ часто возникают инделы (инсерции или делеции) одного или нескольких нуклеотидов, что может привести к сдвигу рамки считывания и нарушению функциональности белка, кодируемого этим участком. Такое нарушение работы какого-либо гена навывают нокаут (knock-out, KO). HDR позволяет осуществить редактирование или вставку в целевой сайт генома фрагмента ДНК несущего желаемый для экспериментатора признак, но для этого необходимо присутствие такого фрагмента в месте действия. Такое внедрение какого-либо гена в геном называют нокин (knock-in, KI). (Кулуев и др., 2017).

Существует большое разнообразие CRISPR/Cas систем. В настоящее время их делят на 2 класса, 6 типов и 19 подтипов (Кулуев и др., 2017). Первый класс CRISPR/Cas систем характеризуется наличием мультисубъединичного комплекса ферментов, называемого Cascade (CRISPR-associated complex for antiviral defence). К этому классу относятся системы I, III и IV типов. Системы второго класса имеют один мультидоменный эффекторный белок и представлены II, V и VI типами.

Наиболее удобной для проведения геномного редактирования оказалась система с эффекторной нуклеазой Cas9 (тип II) и именно она сейчас широко используется (Кулуев и др., 2017). Массовое применение данной системы на практике произошло после того, как было предложено объединить крРНК и тракрРНК в единую направляющую или гидРНК (гидовая РНК, sgRNA, single guided RNA, gRNA) (Jinek et al., 2012). В области геномного редактирования растений первые успешные результаты использования системы CRISPR/Cas9 были опубликованы в 2013 г. (Feng et al., 2013; Li et al., 2013; Nekrasov et al., 2013; Shan et al., 2013; Xie, 2013). При использовании этой технологии ошибочные мутации возникают редко (Xie, 2013) или вовсе не выявляются (Хлесткина и др., 2016). Существенно повысить точность и эффективность модификации помогают тщательный подбор гидРНК (Li et al., 2014) и выбор в качестве мишеней регуляторных

генов, поскольку их изменение чаще всего связано с изменчивостью на фенотипическом уровне (Doebley, 1993; 1998; Хлесткина и др., 2008;

Purugganan, 1998) и такие последовательности имеют более существенный уровень дивергенции, по сравнению со структурными (Purugganan, 1998).

На сегодняшний день существует множество компьютерных программ и баз данных для дизайна экспериментов по CRISPR/Cas и подбору гидРНК с учетом нецелевых сайтов связывания (Чемерис и др., 2017). Также, большое разнообразие плазмид, используемых для CRISPR/Cas редактирования геномов, представлено в репозитории Addgene

5. ПЦР-анализ образцов ДНК из 22 линий бородатых корней

табаков подтвердил событие трансформации в 21 образце. Из них, в 5 образцах обнаружена контаминация A.rhizogenes.

6. Методом pH-дифференциальной спектрофотометрии было выявлено наличие антоциановых пигментов в трех линиях бородатых корней табака и определена их массовая концентрация: линия 6 - 91,8443 г/100г; линия 16 - 5,0097 г/100г; линия 15 - 4,1803 г/100г.

7. В геноме растений из семейства Brassicaceae не было обнаружено гомологичных гидРНК из pTC223 последовательностей, следовательно, требуется поиск генов-мишеней (предпочтительно регуляторных областей генома), участвующих в биосинтезе антоцианов для подбора гидРНК. Таковым может стать ген PAP1.

8. Разработан комплекс методических рекомендаций по применению материала данной выпускной квалификационной работы в школьном курсе «Биология» и урок для 5 классов на тему «Разнообразие, распространение, значение растений».

5. Дрейпер Дж., Скотт Р. Х.Д. Трансформация клеток двудольных растений с помощью Ti-плазмид Agrobacterium tumefaciens и Ri-плазмид A.rhizogenes // Генная инженерия растений / под ред. R.W. J.Draper, R.Scott, Ph. Armitage. Москва: Мир, 1991. С. 408.

+ еще 139 источников