«Идентификация новых изолятов бактерий семейства термоактиномицетов - продуцентов гидролитических ферментов и биологически активных веществ»

Представители термоактиномицетов наиболее часто обнаруживаются в прелых кормах и других растительных материалах, таких как солома зерновых злаков, хлопок, компосты, сено, навоз. Однако, до настоящего времени не были описаны хитин-деградирующие штаммы этих бактерий.

Цель настоящей работы - охарактеризовать и идентифицировать новые хитинолитические изоляты термоактиномицетов, впервые обнаруженные в грунтах пещер Кавказа.

Задачи работы:

1. Изучить культурально-морфологические и физиолого-биохимические признаки новых штаммов согласно основным критериям, разработанным для семейства термоактиномицетов;

2. Установить филогенетическое положение выделенных штаммов в группе Thermoactinomycetaceae на основе анализа гена 16S рРНК.

3. Изучить особенности синтеза внеклеточных хитинолитических ферментов новыми изолятами термоактиномицетов;

4. Изучить некоторые физико-химические свойства хитиназного комплекса наиболее активного штамма.

Ожидаемые результаты и научная новизна работы.

Будут выявлены физиолого-биохимические и экологические особенности новых термофильных штаммов термоактиномицетов, выделенных из грунта пещер, изучена их роль в биодеградации хитина и уточнено филогенетическое положение, и близость к известным видам семейства Thermoactinomycetaceae. Впервые будут описаны новые хитинолитические штаммы термоактиномицетов, выделенные из нетипичных местообитаний - грунтов пещер. Впервые будет охарактеризован ферментный комплекс хитинолитических ферментов, синтезируемых пещерными изолятами термоактиномицетов.

Практическая значимость. Выделенные штаммы могут быть использованы в качестве потенциальных продуцентов термофильных хитиназ для разработки новых высокоактивных препаратов хитинолитических ферментов, перспективных для применения в различных областях промышленной биотехнологии и агробиотехнологий, в том числе для разработки новых средств защиты растений и ферментативной конверсии хитин-содержащего сырья животного и грибного происхождения.

Термоактиномицеты наиболее часто и обильно встречаются в заплесневелых животных кормах и других растительных материалах, таких как солома зерновых злаков, хлопок, компосты, сено и навоз. Их развитию в перечисленных субстратах благоприятствует самопроизвольный разогрев среды, например, навоза, до температур около 70 ° С, что зачастую приводит к их обильному росту с формированием до 107 спор/г сухого веса. Споры легко переносятся по воздуху при разрушении субстрата, однако при ограниченной аэрации рост может быть затруднен. Рост бактерий на агаре снижается вдвое при уменьшении концентрации кислорода в воздухе до 1% (о/о). Хотя в присутствии 0,1% кислорода незначительный рост имеет место, однако споруляция либо полностью прекращается, либо снижается до значений менее 1% [28].

Наиболее распространенным видом термоактиномицетов обычно является Thermoactinomyces vulgaris, однако обычными видами являются

также T. thalpophilus и T. dichotomicus, выделенный из грибного компоста [103]. T. saccharii наиболее обильно встречается в разогретом жоме сахарного тростника (багассе), где он занимает нишу, сходную с таковой у T. thalpophilus и T. vulgaris в заплесневелом сене. Все три перечисленных вида выделены также из почвы и торфа, хотя обычно в небольших количествах, редко превышая 104 КОЕ/г сухого веса почвы [42, 67]. Многие представители термоактиномицетов происходят из навоза, сточных вод или унавоженной почвы [22, 32], хотя возможно также отложение на фермах переносимых по воздуху спор из заплесневелого сена. Некоторый рост термоактиномицетов может происходить на растительности, нагретой под солнечным освещением. Даже в умеренных регионах, солнечное излучение может поднять температуру почвы и мусора до более чем 30°C [34]. Эрозия почвы может приводить к накоплению спор термоактиномицетов в озерных илах и морских отложениях до 104-106 спор/г сухого веса [24]. Присутствие термоактиномицетов в морских экосистемах является надежным и установленным показателем размывания земных пород, поскольку прорастание и развитие спор не имеет места при низких температурах in situ [14, 43, 88]. Обнаружение видов Thermoactinomyces в глубоких буровых кернах и археологических раскопках предполагает, что их споры могут оставаться жизнеспособными в течение тысяч лет и, следовательно, могут быть полезными в качестве палеоиндикаторов в исследованиях сельскохозяйственной истории почв [23, 50, 83, 93, 106]. Виды T.

peptonophilus и T. putidus также были выделены из почвы [84], тогда как вид T. middleus был обнаружен только в кондиционерах, увлажнителях, домашней пыли, и травяном компосте [66], где он встречается с другими видами термоактиномицетов [65].

Классификация термоактиномицетов претерпела значительные изменения со времени первого издания Руководства Берджи по систематике бактерий, в котором они были отнесены к роду Thermoactinomyces [69], таксону, охватывающему преимущественно термофильные организмы. Род Thermoactinomyces и его типовой вид, T. vulgaris, были впервые описаны П.В. Циклинской в 1899 г. Впоследствии были предложены дополнительные виды термоактиномицетов, в том числе T. peptonophilus Nonomura и Ohara 1971, T. sacchari Lacey (1971a), T. candidus Kurup et al. 1975, T. middleus Kurup et al. 1980, T. thalpophilus Unsworth and Cross (1980) и T. putidus Lacey and Cross 1989.

В последние годы T. candidus и T. thalpophilus были реклассифицированы как T. vulgaris и T. sacchari, соответственно, на основе данных ДНК-гибридизации и анализа гена 16S рРНК [116]. Дополнительные сравнительные исследования на представителях достоверно установленных видов Thermoactinomyces показали, что они принадлежат к четырем филетическим линиям, таксономическое положение которых было подтверждено хемотаксономическими и фенотипическими данными [114]. На основе этих данных были предложены три новых рода. T. putidus и T. sacchari были отнесены к роду Laceyella как Laceyella putida и Laceyella sacchari, T. peptonophilus - к роду Seinonella как Seinonella peptonophila, и T. dichotomicus - к роду Thermoflavimicrobium как Thermoflavimicrobium dichotomicum. Пересмотренный род Thermoactinomyces остался исходным таксоном, вмещающим виды T. middleus и T. vulgaris.

Семейство Thermoactinomycetaceae было предложено Matsuo с соавт. (2006) для локализации родов Laceyella, Mechercharimyces, Planifilum, Seinonella, Thermoactinomyces и Thermoflavimicrobium [77]. Данный таксон является одним из семейств, составляющих порядок Bacillales. Отношения между родами, составляющими данное семейство, а также между ними и типовыми штаммами типовых видов некоторых родов, классифицированных в порядке Bacillales, представлены на рис. 1.1.

Субстратный мицелий термоактиномицетов состоит из прочных разветвленных, септированных гиф, из которых развиваются воздушные гифы. Сначала они возникают вертикально, но у большинства видов образуют рыхлую сеть почти прямых гиф над субстратом [76]. 

4. Максимальная продукция хитинолитических ферментов штаммами Laceylla sacchari наблюдается в присутствии коллоидного хитина в качестве источника углерода и достигает 0,2-0,5 ед/мл при стандартных условиях анализа.

5. У большинства изолятов максимум синтеза хитиназ достигает к 1-м суткам периодического культивирования, у штамма L. sacchari 1В-А4 стабильная продукция наблюдается в течение всего цикла культивирования, возрастая к 4-м суткам инкубации.

6. рН-профиль активности хитиназ L. sacchari 1В-А4 характеризуется наличием двух пиков при рН 5,5 и рН 7, что свидетельствует о возможной продукции этим штаммом нескольких ферментов, различающихся по рН- оптимумам гидролиза хитина.

7. Комплексы хитинолитических ферментов всех исследованных штаммов L. sacchari демонстрируют одинаковый температурный оптимум активности (65°С) при интервале наибольшей активности (60-70°С), свойственным для действия термофильных и термостабильных ферментов

+ еще 113 источников