«Разработка метода определения инфекционного титра вируса бешенства на культуре клеток» - Дипломная работа

Содержание

ВВЕДЕНИЕ 4

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8

1.1. Краткая история изучения бешенства 8

1.2. Характеристика возбудителя бешенства 11

1.3. Жизненный цикл вируса бешенства 13

1.4. Устойчивость вируса бешенства 14

1.5. Культивирование вируса бешенства 15

1.6. Локализация вируса бешенства и механизм заражения 16

1.7. Патогенез 16

1.8. Течение и клинические проявления бешенства 18

1.9. Патологоанатомические изменения при бешенстве 19

1.10. Восприимчивость 20

1.11. Методы диагностики бешенства 20

1.11.1. Световая микроскопия 21

1.11.2. Метод флуоресцирующих антител 21

1.11.3. Иммуноферментный анализ 22

11.11.4. Реакция диффузной преципитации 22

11.11.5. Методы основанные на выделении вируса бешенства 23

11.11.6. Метод ОТ-полимеразной цепной реакции 24

Заключение 25

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 26

2.1. Материал исследования 26

2.2. Порядок культивирования клеток линии Vero 26

2.3. Метод определения концентрации вируса на культуре клеток 31

2.4. Метод иммуноферментного анализа для проведения контроля антигенной активности вируса бешенства 35

2.5. Порядок расчета инфекционного титра вируса бешенства с помощью результатов метода иммуноферментного анализа 45

2.6. Метод дидактической многомерной технологии (логико-смысловая модель) 46

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 48

3.1. Пдбор метода для оценки инфекционного титра 48

3.2. Подбор оптимальной концентрации клеток для монослоя культуры клеток Vero 48

3.3. Подбор разведения вируса бешенства для инфицирования культур клеток Vero B при разных дозах клетки и определение необходимой длительности культивирования 49

3.4. Применение разработанного метода определения инфекционного титра на культуре клеток при оценке биоконцентрации лиофилизатов вируса бешенства штамма Внуково-32 52

3.5. Сравнительная оценка инфекционного титра вируса бешенства в поддерживающей среде с сывороткой 2 % КРС и 5% аминопептида 54

Обсуждение 57

ГЛАВА 4. МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ПРИМЕНЕНИЮ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО МАТЕРИАЛА ВЫПУСКНОЙ КВАЛИФИКАЦИОННОЙ РАБОТЫ В ШКОЛЬНОМ КУРСЕ БИОЛОГИИ 59

4.1. Роль биологического образования в школе 59

4.2. Разработка урока на тему «Нервная система», 8 класс 62

4.3. Использование логико-смысловой модели в процессе биологического

образования 75

ВЫВОДЫ 79

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 80

Введение

Бешенство (Rabies)- острая инфекционная болезнь животных и человека, которая характеризуется энцефалитами, параличами, поражением ЦНС и неизбежной летальностью. Возбудителем этой болезни является нейроторопный фильтрующийся вирус, который принадлежит группе миксовирусов из семейства Rhabdoviridae, род Lyssavirus. (Кроль Н.М)

Бешенство является одним из основных инфекционных болезней, которые считаются опасными для человека и животных, наносящее экономический и социальный ущерб. Животные и люди заражаются при укусе или ослюнении инфицированными животными этим и связана опасность рабической распространения инфекции.

На сегодняшний день бешенство всё еще остается неизлечимым заболеванием. Ежегодно в мире от бешенства погибают до 50 тыс. людей и больше 1 млн животных.

Для профилактики бешенства используют инактивированные антирабические вакцины, а для диких животных оральные вакцины.

Определение инфекционного титра вируса бешенства позволяет использовать вирус для дальнейшего экспериментального заражения животных, производства противовирусных вакцин, диагностических препаратов.

Актуальность. Обычно для выделения и определения инфекционного титра вируса бешенства используют метод биопробы на белых мышах. Однако, несмотря на высокую чувствительность, этот метод имеет ряд недостатков, связанные с использованием лабораторных мышей, что затрагивает экологические и этические вопросы. И считается неэкономичным, так как при этом требуется особое виварное помещение и обслуживающий персонал. Также данный метод имеет длительность постановки ( отрицательный результат может быть получен через несколько недель). А чувствительность метода биопробы на мышах во многом зависит от сезонности, возраста и пола мышей.

Использование культур клеток для выделения вируса и оценки инфекционного титра значительно сокращает время для обнаружения возбудителя и постановки диагноза от 21-25 до 2 сут. и исключают опыты на экспериментальных животных.

Таким образом, из-за недостатка стандартных методов оценки инфекционного титра вируса бешенства, которые не дают возможность сделать точные выводы, разработка метода по определению биоконцентрации вируса бешенства на культуре клеток для дальнейшего экспериментального заражения животных, производства противовирусных вакцин, диагностических препаратов, является актуальным направлением исследования.

Цель выпускной квалификационной работы заключается в разработке методов, позволяющих оценить концентрацию вируса бешенства на культуре клеток.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Подбор метода для количественной оценки инфекционного титра вируса бешенства.

2. Подбор монослоя культуры клеток Vero B для культивирования вируса бешенства.

3. Подбор условий культивирования вируса бешенства на культуре клеток.

a) Разведения вируса бешенства

b) Длительность культивирования

4. Оценка инфекционного тира трех проб лиофилизатов коллекций ВБ для подбора рабочего материала.

5. Сравнительная оценка инфекционного титра вируса бешенства в поддерживающей среде с сывороткой 2% КРС и 5% аминопептидом.

6. Разработка рекомендации по методике применения теоретического и практического материала, используемого в ВКР, в школьном курсе "Биология".

Научная новизна заключается в использовании культур клеток для определения концентрации вируса бешенства, вместо стандартного метода биопробы на мышах, а также применение метода иммуноферментного анализа, результаты которого позволят количественно определить инфекционный титр вируса бешенства.

Практическое значение. Полученные результаты по инфекционному титру вируса бешенства на культуре клеток Vero B позволит использовать в дальнейшем метод определения инфекционного титра вируса бешенства на культуре клеток вместо метода биопробы на мышах, что повысит скорость диагностики, значимость лабораторных мышей и снизит трудозатраты.

Апробация. По материалам данной выпускной квалификационной работы опубликована статья «Методы диагностики бешенства» в журнале «Modern science» № 6 [Июнь] 2019 (согласно справке о принятии статьи к публикации №ВНО-2886 от 17.06.2019)

Выдержка из текста работы

ГЛАВА 1. БЕШЕНСТВО. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА. (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. Краткая история изучения бешенства.

Первые сведения о бешенстве были описаны еще в древних источниках: в греческих письменах, египетских свитках, в индийских Ведах. Демокрт 500 лет до н.э. подробно описал заболевание животных бешенством. Он считал, что бешенством страдают только животные. Аристотель 322 года до н.э. установил, что бешеные собаки заражают других животных во время укуса.

Корнелий Цельс (первое столетие н. э.) подробно изучил симптоматологию гидрофобии у человека, а так же отметил, что вирус бешенства человеку передается во время укуса бешеной собакой и для уничтожения вируса необходимо прижигать укушенную рану.

В XVIII и XIX столетиях наблюдался особый интерес к бешенству. Возможно, как указывают некоторые авторы, это «благодаря повышению социально-экономического значения повсеместных эпизоотий этой болезни». До 1785 года публиковались более 300 сочинений о бешенстве за рубежом и в России. [1] В 1780 году российский медик Данило Самойлович установил инфекционную природу заболевания бешенством. Однако до начала XIX века не было известно о течении смертельного заболевания бешенства.

В 1804 году немецкий ученый Г. Цинке в своем опыте по заражению здоровой собаки слюной и тканью мозга бешеного животного, установил, что бешенство передается другому животному, за счет попадания в кровь или под кожу слюны инфицированного животного. Благодаря его работам началось подробное изучение бешенства.

В 1873 году Ланге и Галтье (1879) установили большую восприимчивость кроликов к вирусу бешенства.

1879 году Кругельштейн отметил, что вирус бешенства локализуется в нервной ткани.

В 1887 году В. Бабеш, изучая мозг погибших от бешенства животных, обнаруживает специфические цитоплазматические включения в нейронах центральной нервной системы. А в 1903 году итальянский ученый А. Негри диагностически подтверждает находку Бабеша. И с 1950 года, найденные элементы, представляющие собой скопления вируса бешенства, называют тельцами Бабеша-Негри.

Работы Луи Пастера открыли новые возможности в профилактике бешенства.

Еще в 1881 году Галтер заразив овец слюной бешенного животного, вызывает у них невосприимчивость к бешенству. Он считал, что невосприимчивость может появляться только у травоядных животных. А Пастер для культивирования вируса бешенства использовал мозг инфицированных животных. Так он субдуральным методом заражал кроликов вирусом бешенства, выделенный из мозга бешеной собаки. При пассировании вируса от кролика к ролику, Пастер установил, что постепенно сокращается инкубационный период вируса. Это позволило выявить фиксированный вирус, который отличался от уличного вируса тем, что он был адаптирован к нервной ткани кроликов и в значительной степени утратил свою патогенность к другим видам животных и человеку. Высушивая над кристаллами едкого калия зараженный мозг кролика, Пастер достиг полной потери вирулентности. (Селимов М.А)

Затем при иммунизации собаки полученной вакциной он установил возможность выработки невосприимчивости. В 1884 году Пастер сделал первый доклад об успешной вакцинации собаки от бешенства. А в 1885 он впервые с успехом применил вакцину для иммунизации людей и спас жизнь девятилетнему Жозефу Мейстру, которой был заражен вирусом после укуса бешеной собаки.

После открытия вакцины против бешенства, для ознакомления со способом получения вакцины, общество одесских врачей направил к Пастеру доктора Н.Ф. Гамалея. Ему, работая вместе с Пастером, удалось доказать необходимость проведения прививок в ранние сроки. Вскоре после этого в 1886 году в Одессе открыли второю в мире бактериологическую станцию, где И.И. Мечников, Н.Ф. Гамалея и Я.Ю. Бардах получили первую отечественную вакцину против бешенства и усовершенствовали методы вакцинации.

Заключение

1. Оптимальная доза концентрации клеток для монослоя культуры клеток Vero B 60 тыс кл\мл.

2. При инфицирование культур клеток необходимо использовать десятикратное разведение и 60 тыс кл\мл дозу клеток. А длительность культивирования должна составлять 2 недели.

3. Две серии ампулированных образцов вируса бешенства лиофильно высушенных в 2011 году обладают инфекционной активностью при раститровке на культуре клеток превышающий 106 ИД50/мл, и каждая из них проходит по этому критерию в претенденты на рабочий посевной материал ВБ.

4. Результат титрования образца №1 ВБ с использованием 2% сыворотки КРС в 10 раз ниже такового с использованием 5% аминопептида, что свидетельствует о наличии в сыворотке КРС антител к ВБ;

5. Разработаны методические рекомендации по использованию результатов исследования в курсе «Биология».

Список литературы

1. Авцын А.П., Кармышева В.Я., Кондакова Л.И. и др. Новая нейрогенная клеточная линия НГУК-1 и ее применение в биотехнологии и медико-биологических исследованиях. Культивирование клеток животных и человека. Тез. докл. II Всесоюз. совещ. Пущино; 1985: 75-6.

2. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях/ Л.: Гос. изд. мед. лит., 1962.-186 с.

3. Белик Е.В, Дудникова С.А, Бельчихина А.В, Лядский М.М, Дудорова М.В\ Эпизоотическая ситуация по бешенству.,-2009г

4. Волкова А.В\Культивирование штамма внуково-32 в культуре перевиваемых клеток для производства антирабической

вакцины\автореферат, Москава-1997

5. Грибенча С.В., Львов Д.К. Рабдовирусы. В кн.: Львов Д.К., ред. Медицинская вирусология. М.: МИА; 2008: 586-94.

+ еще 58 источников

Примечания

Оригинал в pdf