«Разработка метода определения антител, нейтрализующих вирус бешенства, в сыворотках крупного рогатого скота»

Бешенство (Rabies)- острое зоонозное, вирусное прогрессирующее заболевание млекопитающих, в том числе человека, которое характеризуется продолжительным инкубационным периодом с последующим поражением центральной нервной системы, энцефаломиелитами, гиперемии, параличами и неизбежной летальностью. Вирус, вызывающий бешенство, относится к группе миксовирусов рода Lyssavirus семейства Rhabdoviridae. Все лиссавирусы являются нейротропными инфекционными агентами, способные подорвать любой иммунный ответ хозяина, который установлен, и, таким образом, исход инфекции является фатальным почти в 100% случаев.

Вирус бешенства передается человеку со слюной больного животного через укус, далее из мышечной ткани, достигнув нервных окончаний, вирус начинает распространяться центростремительно по центральной нервной 5

системе, вызывая острый прогрессирующий энцефалит со смертельным исходом. В зависимости от места укуса, инкубационный период длится в среднем от 15 до 45 суток, а скорость продвижения вируса составляет около 8 см в день (S. Gluska, E.E. Zahavi, M. Chein, 2014). Бешенство, как правило, не распространяется от человека к человеку — хотя очень редко, он может распространяться от одного человека к другому во время трансплантации органов. Также возможна вертикальная передача вируса от матери, укушенной животным, ребенку.

На сегодняшний день единственным способом предотвратить заболевание и последующий летальный исход является своевременное введение антирабической вакцины пациенту. Вакцина против бешенства способна стимулировать высокий уровень вируснейтрализующих антител.

Наличие в сыворотке крови вакцинированных животных вируснейтрализующих антител является индикатором эффективности вакцинации, так как только вируснейтрализующие антитела рассматриваются как основа защиты против рабической инфекции (В. Dietschold, М. Lafon, 1990). Для выявления антител к вирусу бешенства необходима точная и быстрая диагностика. Из-за того, что титр АТ в изучаемых сыворотках невысокий, то стандартная РН не подходит.

Цель: разработка метода, позволяющий выявить наличие

вируснейтрализующих антител к вирусу бешенства в сыворотках КРС.

Задачи:

- подбор оптимальных условий проведения анализа;

- выявление наличия антител, нейтрализующих вирус бешенства, в различных сериях сывороток КРС на культуре клеток с помощью РН;

- определение титр антител к вирусу бешенства в исследуемых сыворотках с помощью ИФА;

- интерпретация результатов исследования;

- разработка методических рекомендаций по использованию результатов исследования в курсе «Биология».

Научная новизна: впервые использован метод ИФА для культуральных жидкостей. При работе с разработанным методом нет субъективности в оценке, что присуще ФИТЦ-антителам. Кроме того, предложенный метод отличается от стандартной РН тем, что не требует дорогостоящего флуоресцентного микроскопа, который требует технического обслуживания, квалифицированного персонала для интерпретации теста.

Практическая значимость: использование в качестве субстрата для опыта культур клеток значительно снижает трудозатраты, которые присуще при работе с лабораторными животными. Метод на основе культур клеток считается достойной альтернативой традиционному методу на мышах по ВОЗ и не уступает ему по своей чувствительности и более контролируем. Ввиду биоэтических проблем использование лабораторных животных для экспериментов контролируется 3И-стратегией, цель которой заменить животных на модели.

Апробация: по вопросам изучения вируса бешенства и современных методах диагностики была опубликована статья в международном научном журнале «Colloquium» (Варшава, 2019, выпуск №13 (37), входящий в

перечень РИНЦ.

Но позже выяснилось, что высушивание зараженного мозга приводит ВБ не просто к ослаблению, а к полной потере вирулентности. Таким 8

образом, по незнанию, вместо ослабленных живых микроорганизмов он создал нейтрализованный агент и открыл путь для разработки вакцин второго класса, известных как инактивированные вакцины.

В 1892 г. В.Бабеш, а в 1903 г. А.Негри обнаружили и описали специфические внутриклеточные включения в нейроцитах погибших от бешенства животных, чем существенным образом облегчили установления посмертного диагноза, но название Бабеша-Негри появилось только в 1950 г.

В 1903 г. сотрудник института Пастера в Париже П. Ремленже установил, что возбудителем бешенства является не бактерия, а фильтрующийся вирус.

Вскоре появилось множество модификаций вакцины Пастера. Филипс предложил содержать вируссодержащую мозговую взвесь в глицерине, а перед вакцинацией разводить в физиологическом растворе и феноле. Этим можно увеличить срок годности вакцины до 1 месяца (М. Селимов, 1978).

Затем были созданы антирабические вакцины, частично или полностью инактивированные путем физического и химического воздействия. Из вакцин, инактивированных физическим воздействием, а именно, действием ультрафиолетовых лучей, известна вакцина Уэбстера и Касальса. Такая вакцина до сих пор используется в практике.

В 1907 г. Ферми для инактивации вируса начал использовать фенол. Вакцина, приготовленная по Ферми, содержит некоторое количество живого вируса, что привело к развитию осложнений под названием «лабораторное бешенство». Ремленже предложил готовить антирабические вакцины путем ослабления фиксированного вируса эфиром. Вакцина Хемпта, частично инактивированный, также вызывала осложнения.

Модификацией вакцины Ферми стала вакцина Семпла, в которой вирус полностью инактивирован, но из-за содержания в них миелина нередко вызывали неврологические осложнения у пациентов и для снижения реактогенности был налажен выпуск инактивированных вакцин на основе вируса из мозга новорожденных животных (E. Fuenzalida, 1973), однако и эти вакцины оказались энцефалитогенными. Такой тип вакцины, выведенная из головного мозга овец, по-прежнему производится и используется в Эфиопии, несмотря на то, что эта вакцина не поощряется ВОЗ с 1990-х годов.

Еще одним общим недостатком всех применяемых тогда вакцин является их термолабильность и ограниченный срок годности.

Использование нейронной тканевой вакцины было очень распространено, но, к сожалению, вызывал поствакцинальный энцефалит. Этот тип вакцины оставался связанным с тяжелыми неврологическими реакциями из-за производства АТ против миелина или других веществ нервной ткани животных, присутствующих в продукте. Белок миелина в вакцине стимулирует иммунный ответ и в то же время действует на нервную систему реципиента. Наличие остаточного живого вируса в некоторых ранних препаратах из-за недостаточной инактивации привело к самому заболеванию. Таким образом, использование нейронной вакцины постепенно прекращалось, как это было рекомендовано Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ).