«Подбор методов стерилизации для введения в культуру тканей и органов беламканды китайской (belamcanda chinensis)»

Эффективность сохранения генофонда растений ex situ может быть повышена путем создания генетических банков меристем, сохранения растительного материала в условиях in vitro (культура изолированных меристем, тканей и органов растений в условиях замедленного роста).

Объектом моей выпускной квалификационной работы является беламканда китайская Belamcanda chinensis (L.) DC. В естественных условиях данный вид можно встретить в Дальневосточном Приморском крае России, в странах Восточной Азии, Индо-Китае и Малайзии. На данный момент растение находится на грани исчезновения. С 1978 г. занесен в Красные книги СССР, РСФСР и России под категорией 1 - растения,

находящиеся под угрозой вымирания.

Для сохранения этого вида необходимо полномасштабное исследование процессов онтогенеза в культуре in vitro и подбор условий для введения в стерильную культуру.

Широко известно, что Ирисы подвержены инфекциям патогенных бактерий и грибов. Бактериоз (возбудитель Erwinia ceratovora или Pectobacterium carotovorum) или, как ее еще называют, мягкая гниль корневищ является опасным заболеванием растений. При традиционных методах размножения крайне трудно добиться здорового посадочного материала, так как велика вероятность накопления и передачи инфекции.

Именно поэтому большое значение при введении в культуру in vitro имеют методы стерилизации, которые подбираются в зависимости от видовых особенностей экспланта.

Выращивание беламканды в ботанических садах имеет большое практическое значение, так как растение обладает высокими декоративными качествами. Как декоративное растение Беламканда выращивается в большинстве стран Азии, Юго-Восточной Европы и Америки. В России Беламканда мало известна, хотя была культивирована многими ботаническими садами, в частности в Москве, Санкт-Петербурге, Пензе, Ростове-на-Дону, Самаре, Казани, Ставрополе. Беламканда хорошо прорастает в теплоумеренной зоне средней полосы России и рекомендована в качестве декоративного растения открытого грунта (Родионенко, 1977),

Беламканда считается ценным лекарственным растением в азиатских странах. Она используется при жаре, при воспалении, при мокроте, при отравлении, а также принимают как противомикозное, патогенное, диуретическое и слабительное средство (Растительные ресурсы., 1994). В Китае, Индии и во Вьетнаме беламканда культивируется как ценное лекарственное растение, применяется в виде экстрактов и суспензий. Является одним из важных элементов традиционной китайской медицины.

Беламканда китайская до начала 21 века вид считался единственным представителем рода Belamcanda в результате молекулярно-генетических исследований, проведенных в 2005 году, растение было включено в род Iris ботаником Миссурийского ботанического сада Петером Голдблаттом как Iris domestica (L.) Goldblatt & Mabb. (Вяль и др., 2014).

Беламканда китайская давно введена в клеточную культуру и считается испытанным растением, однако практика ее выращивания в ЮУБСИ УФИЦ РАН доказывает, что особенности её развития в условиях, далёких от экологического оптимума были изучены совершенно недостаточно.

Особенный интерес представляет изучение семян беламканды, имеющих прямую связь с возможностью генеративного размножения.

Чтобы получить качественный посадочный материал в лаборатории генетики и биотехнологии растений Южно-Уральского ботанического сада- института УФИЦ РАН разрабатываются технологии микроклонального размножения Belamcanda chinensis.

Цель работы: подобрать оптимальные условия для введения в культуру тканей и органов беламканды китайской и изучить этапы ее развития в системе in vitro.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Выявить наилучший вид первичного экспланта.

2. Определить оптимальную схему стерилизации для фрагментов корневища, корневищных почек и семян, которая позволит получить максимальное количество стерильного и жизнеспособного экспланта.

3. Изучить влияние предстерилизационной обработки фрагментов корневища и корневищных почек на стерильность культуры.

4. Изучить влияние предпосевной обработки семян на жизнеспособность проростков.

5. Подобрать наиболее эффективный состав питательной среды для увеличения коэффициента скорости побегообразования проростков.

6. Изучить начальные процессы развития беламканды китайской в условиях in vitro.

7. Разработать методические рекомендации по использованию теоретического и экспериментального материала ВКР в школе.

Научная новизна работы.

Новизна исследовательской работы заключается в разработке технологии микроклонального размножения беламканды китайской, делая акцент на подборе способов стерилизации и подборе питательных сред для индуцирования морфогенеза. Так же был проведен анализ стерильности и жизнеспособности эксплантов, коэффициента мультипликации и скорости побегообразования, используя различные виды первичного экспланта.

Практическая значимость.

Данная технология позволяет получать стабильные растения- регенеранты для сохранения их в коллекции in vitro. Также эта технология может применяться для быстрого размножения растений для сохранения популяции беламканды как редкого растения.

Апробация.

Работа выполнена в лаборатории генетики и биотехнологии при Южно-Уральском ботаническом саде-институте УФИЦ РАН.

Продуктами выпускной квалификационной работы является статья, опубликованные в сборнике «Вавиловские чтения-2018» посвященный 131- летию со дня рождения академика Н.И.Вавилова: «Онтогенез и начальные этапы размножения беламканды китайской Belamcanda chinensis (L.) DC. В культуре in vitro».

В качестве эксплантов использованы семена 2016 года репродукции, с растений, выращенных из собственных семян, полученных в условиях ЮУБСИ УФИЦ РАН, собранных на стадии биологической спелости в третьей декаде октября. Первоначально семена в 2014 году были получены по делектусу из Самары.

Работа проводилась поэтапно:

Май - июнь 2017 года - посадка семын беламканды в закрытый грунт.

Октябрь - декабрь 2017 года - подбор способов стерилизации корневищных почек.

Февраль - март 2018 года - подбор способов стерилизации и увеличчения всхожести семян

Апрель 2018 года - изучение роста и развития беламканды в условиях in vitro, подбор состава питательных сред для увеличения скорости побегообразования проростков.

Май - июнь 2019 года - оформление ВКР.

Методика исследований базировалась на общепринятых классических приемах с культурами изолированных тканей и органов растений.

В качестве исходного материала для микроклонального размножения были использованы стерильные проростки. В качестве первичных эксплантов для введения в стерильную культуру использованы семена и корневищные почки. Первичные экспланты высаживали на безгормональную питательную среду с минеральной основой по прописи Мурасиге-Скуга, на которой образовывались проростки. Далее их делили на фрагменты и пересаживали на модифицированные питательные среды для получения пролиферирующей культуры.

Статистическая обработка данных проводилась по методике Б.А. Доспехова.

2.2. Создание условий асептики

Для соблюдения условий асептики при выполнении работ по культивированию растений in vitro стерилизации должны подвергаться операционная комната, в которой производят изоляцию и посадку культур, одежда и руки работающего персонала, посуда, используемая для культивирования объектов, все необходимые инструменты и материалы, питательные среды, объекты культивирования.

2.2.1. Дезинфекция лабораторных приборов и оборудования

Вся посуда, предназначенная для приготовления, хранения питательных сред и выращивания растительного материала, подвергается тщательной обработке.

Чистую посуду, предварительно завернутую в бумагу или фольгу, сушат сухим жаром в сушильном шкафу при температуре 160 0С в течение 1,5-2 ч.

Предварительная стерилизация инструментов (скальпелей, пинцетов, игл и т.д.) заключается в нагревании сухим горячим жаром в сушильном шкафу в течение 2 часов при температуре 140оС (Черевченко, 2008).

Стерилизация сухим жаром в печах Пастера. Печь Пастера - двухстенчатый сушильный шкаф. В печах Пастера стерилизуют стеклянную посуду, пробирки, чашки Петри, шприцы, металлические инструменты, обернутые для последующего сохранения стерильности до применения в работе. Нельзя стерилизовать сухим жаром воспламеняющиеся вещества, питательные среды, воду, резиновые предметы (Маннапова, 2018).

Несмотря на имеющиеся экспериментальные работы в области изучения процессов морфогенеза и регенерации растений в условиях культуры тканей, для ириса до сих пор остаются недостаточно разработанными системы получения растений in vitro. Это обусловлено отсутствием четких, хорошо воспроизводимых методик, их трудоемкостью, недостатком знаний о этапах роста и развития эксплантов в культуре органов и тканей, а также способах управления морфогенезом для этой культуры.

В данной работе были проведены исследования по подбору оптимальной схемы стерилизации корневищных почек и семян, подбору питательных сред для индуцирования морфогенеза проростков, были изучены влияния предстерилизационной обработки корневищных почек антибиотиком и предпосевной обработки семян методом стратификации и скарификации и было изучено развитие беламканда в культуре in vitro.

Требуются дальнейшие исследования по подбору питательных сред с содержанием антибиотиков для более мягкой стерилизации корневищных почек и увеличения их жизнеспособности.

3. Т.Б., Васильева В.Е. Размножение растений. СПб.: С-Петерб. унта, 2002. - 232 с.

4. Биологическая энциклопедия. Применение антибиотиков в растениеводстве. -2010. ac**emic/ru.

5. Болтенков Е.В. Культура клеток — альтернативный способ сохранения и использования дальневосточных видов Iris L. // Докл. 2 Всероссийской конференции «Проблемы региональной экологии». Томск, 2000 - С. 150.

+ еще 45 источников