«Влияние продуцирующих липопептиды бактерий рода bacillus на устойчивость растений картофеля к грибным патогенам»

Значительный интерес у биотехнологов вызывают стимулирующие рост растений микроорганизмы (СРРМ), и, в особенности, эндофитные штаммы бактерий, способные снижать или устранять негативное воздействие фитопатогенных микроорганизмов на растения (Чеботарь и др., 2016). Многие эндофитные микроорганизмы, обладающие способностью продуцировать биологически активные вещества, в том числе ферменты и липопептидные антибиотики, принадлежат к роду Bacillus. Липопептидные антибиотики, вырабатываемые бактериями рода Bacillus, оказывают непосредственное влияние на защитные реакции растений. Такие бактерии являются наиболее распространенными агентами биологической защиты (Price , Rooney et al 2007).

Но до сих пор нет точного описания механизма воздействия эндофитных микроорганизмов на защитную систему растений (Максимов и др., 2014).

Под действием различных токсичных соединений и стрессовых факторов у растений в тканях развивается окислительный стресс, который связан с высокой продукцией активных форм кислорода (АФК). АФК, с одной стороны, являются сигнальными молекулами для запуска реакции сверхчувствительности (СВЧ-реакции) и могут проявлять фунгитоксичные свойства (Aver'yanov, Lapikova, 2007), а с другой - их избыток отрицательно сказывается на жизнедеятельности самой растительной клетки. Баланс АФК в растениях поддерживается слаженной работой систем, их продуцирующих (НАДФН-оксидаза, оксалатоксидаза, пероксидаза и др.) и утилизирующих (каталаза, пероксидаза) (Воскресенская, 2006).

Пероксидаза - это фермент, принимающий участие в формировании и лигнификации клеточных стенок, синтезе этилена, регуляции уровня ауксина, а также защищает ткани от поражения и инфекции, наносимый патогенными микроорганизмами и относится к ферментам, чувствительным к воздействию неблагоприятных факторов. Каталаза - один из самых активных энзимов в природе, принимает участие в процессах адаптации организма к стрессовым факторам (Половникова , 2010).

Таким образом, защитный эффект эндофитных микроорганизмов на растения складывается из их способности активировать защитные механизмы в растениях, увеличивать доступность для них минеральных веществ при стрессе, а так же синтезировать антибиотики, напрямую влияющие на патоген. Поэтому важной задачей является изучение роли липопептидных антибиотиков, характерных для бактерий рода Bacillus, в защите растений от патогенов.

Для экспериментов оригинальный штамм бактерии B. subtilis 26Д был выделен из коммерческого препарата Фитоспорин М. На основе этого штамма н.с. Благовой Д.К. были получены линии с нокаутированными

генами биосинтеза сурфактина sfp (4-фосфопантенил-трансфераза, X63158.1) и sfp (L17438.1) (Grossman et al, 1993). Штамм B. subtilis 11ВМ,

продуцирующий итурин, был выделен из внутренних тканей растений хлопчатника.

Целью работы было изучение антагонистического эффекта бактерий Bacillus subtilis по отношению к фитопатогенным грибам и изучение их влияния на биохимические показатели инфицированных растений картофеля.

Задачи:

1. Исследовать антифунгальную активность штаммов бактерий рода Bacillus по отношению к фитопатогенным грибам in vitro

2. Исследовать содержание бактерий рода Bacillus во внутренних тканях растений.

3. Изучить содержание перекиси водорода, активность ферментов пероксидазы и каталазы при обработке растений эндофитными микроорганизмами.

4. Определить влияние бактерий на развитие симптомов фитофтороза в растениях, инфицированных P. infestans

5. Исследовать влияние бактерий на развитие окислительного взрыва при инфицировании растений P. infestans.

6. Разработать рекомендации по методике применения теоретического и практического материала, который используется в ВКР для школьного курса «Биология».

Научная новизна

В работе впервые показано, что продуцирующий сурфактин штамм B. subtilis 26Д характеризуется высокой способностью проникать в ткани растений, не вызывая окислительного взрыва, как происходит в случае не продуцирующих сурфактин штаммов. Эндофитные свойства этого штамма коррелируют со способностью стимулировать накопление АФК и активацию пероксидаз в растениях, инфицированных возбудителем фитофтороза и, тем самым, снижать их пораженность заболеванием. Так же показано, что

штаммы со сниженной продукцией сурфактина в меньшей степени обладали антифунгальными свойствами по отношению к возбудителям гнилей картофеля.

Научно-практическая значимость

В настоящее время перспективным направлением является

разработка эффективной защиты растений от патогенов методом их симбиотической бактеризации. Создание биопрепаратов, содержащих эндофитные микроорганизмы, позволяет не только защищать вегетирующие растения от вредителей и болезней, но будет способствовать снижению числа защитных мероприятий, которые будут заменены предпосевной обработкой посадочного материала целевыми штаммами и формированием микробиома, сохраняющегося с начала вегетативного периода до самого хранения (Благова и др., 2016).

Апробация

По материалам данной выпускной квалификационной работы опубликована статья. Сорокань А. В., Бурханова Г. Ф., Искандарова З. М., Максимов И. В. Роль активных форм кислорода в регуляции взаимодействия растений картофеля с симбиотическими эндофитными бактериями Bacillus subtilis 26Д // Экология и эволюция: новые горизонты: материалы международного симпозиума, посвященного 100-летию академика с. С. Шварца (1-5 апреля, 2019, г. Екатеринбург). — Екатеринбург: гуманитарный университет, 2019. — 698 с.

Работа выполнена в лаборатории биохимии иммунитета растений Института биохимии и генетики - обособленного структурного подразделения Федерального государственного бюджетного научного учреждения Уфимского федерального исследовательского центра Российской академии наук (ИБГ УФИЦ РАН). Выражаю искренние слова благодарности своему научному руководителю к.б.н. Сорокань Антонине Вячеславовне за неоценимую помощь в организации исследований и интерпретации результатов; заведующему лабораторией биохимии иммунитета растений Института биохимии и генетики УФИЦ РАН, д.б.н., профессору Максимову Игорю Владимировичу за предоставленную мне возможность работать в данном научном учреждении; сотрудникам лабораторией биохимии иммунитета растений Института биохимии и генетики УФИЦ РАН

Картофель является полезным продуктом из-за богатого химического состава: углеводы составляют 20%, белки - 2%, вода и небольшой объем жиров приходится на 80%, а также в сотаве имеются витамины и минералы, которые благоприятно влияют на организм человека и способствует укреплению иммунитета. В составе белков есть все аминокислоты, которые встречаются в растениях, к их числу относятся и незаменимые. В свежих клубнях картофеля витамина С составляет около 20 мг в виде восстановленной формы аскорбиновой кислоты. В старых клубнях содержание витамина С снижается. Также с составе клубней имеются следующие витамины (объем представлен в %): В1 - 0,11; В2 - 0,06; РР - 0,57; В6 - 0,22; В9 - 0,0008; пантотеновая кислота - 0,32 (Пшеченков и др., 2013).

Полезные свойства:

• витамина B6 влияет на защиту организма от радиоактивного облучения • витамин C нейтрализует содержание холестерина в крови, защищает организм от ядов, применяется в качестве антистрессового средства

• витамин P в содружестве с витамином C способствует укреплению стенок кровеносных сосудов, способствует снижению повышенного артериального давления и активизирует функции коры надпочечников, увеличивает желчеотделение

• Витамин РР улучшает усвоение организмом растительных белков, регулирует секреторную и моторную функции желудка, увеличивает активность печени, направленную на уничтожение токсинов (Пшеченков и др., 2013).

Картофель считается одним из экономически значимых и самых урожайных культур в области сельского хозяйства. Некоторые сорта картофеля, полученные на основе нынешней селекции, гарантируют объем урожая более тысячи ц/га. Несмотря на это, на протяжении всего времени среднее значение урожая картофеля в стране составляет 90-120 ц/га, что означает довольно низкий уровень. Основным фактором является то, что картофель во время вегетации способен накапливать вирусную инфекцию, что приводит к болезням разного рода, которые зачастую являются причиной быстрого снижения урожая. Болезни способны поражать картофель и в период хранения (Кваснюк и др., 2006).

Возбудителями заболеваний картофеля считаются бактерии, грибы, вирусы и микоплазмы. Возрастают потери урожая от таких грибковых болезней, как альтернариоз (макроспориоз), фитофтороз, фузариоз, ризоктониоз, рак картофеля, фомоз и следующие виды парши: обыкновенная, порошистая, бугорчатая. Ежегодный недобор урожая картофеля из-за фитофтороза (возбудителем является P.infestans (Мой.) de Вагу) составляет около 15%, в дождливые годы эта цифра возрастает до 30 - 50% (данные НИИ картофеля имени А.Г. Лорха). С этой точки зрения изучение механизмов устойчивости картофеля, а так же способов ее модулирования с помощью биопрепаратов на сегодняшний день представляется одной из перспективных задач физиологии растений.

Применение препаратов для протравливания клубней считается одним из многообещающих направлений увеличения продуктивности картофеля. Каждый год объем их использования возрастает. Протравители применяют не только с целью воздействия на ростовые процессы и развитие растений, однако, и для снижения отрицательного влияния негативных средовых факторов в период вегетации (Медведева, 2012).

Объем использования химических средств в качестве защиты при выращивании растений ежегодно увеличивается. В стремлении к высокому урожаю производители применяют большое количество химических препаратов, избавляющие от вредных объектов, однако упускают момент отрицательной стороны из-за массового применения. В настоящее время потребление пестицидов приравнивается к 8-10 кг/га.

В борьбе с вредителями и заболеваниями, пестициды представляют значительную нагрузку на агроэкосистемы, так как идет накопление вредных веществ в самих растениях, а также в почве. К тому же, каждый год используются семена, полученные из многократно химически обработанных растений. Исходя из этих причин, появляется важность и нужность уменьшения пестицидной нагрузки. Одним из способов снижения химической нагрузки на агроценозы является использование биологических препаратов для защиты растений с использованием культур микроорганизмов (Сатарова, 2009).