«СИГНАЛЬНЫЕ СВЯЗИ АЛЛЕЛЕЙ ГЕНОВ ЛЕПТИНА (LEP), БЕЛКА Notch1 (NOTCH 1) И ЦИКЛИН-ЗАВИСИМОЙ КИНАЗЫ 4 (CDК4) ПРИ РАКЕ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ» - Дипломная работа

Содержание

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ 4

ВВЕДЕНИЕ 5

ГЛАВА 1. МОЛЕКУЛЯРНЫЙ МЕХАНИЗМ КАНЦЕРОГЕНЕЗА ПРИ РАКЕ МОЛОЧНЫХ ЖЕЛЕЗ (ОБЗОР НАУЧНОЙ ЛИТЕРАТУРЫ) 8

1.1. Роль жировой ткани в опухолевой трансформации 10

1.2. Генетическая регуляция клеточного цикла при канцерогенезе молочных желез 12

1.3. Сигнальные пути и взаимодействие белков Leptin, Notch1 и Cdk4 при канцерогенезе молочных желез 15

1.4. Ген LEP и его продукт 17

1.4.1. Полиморфизм rs7799039 гена LEP 19

1.5. Ген NOTCH1 и его продукт 19

1.5.1. Полиморфизм rs6563 гена NOTCH1 20

1.6. Ген CDK4 и его продукт 21

1.6.1. Полиморфизм rs373619077 гена CDK4 22

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 24

2.1. Материалы исследования 24

2.2. Методы исследования 25

2.2.1. Биохимические методы 25

2.2.1.1. Выделение ДНК методом фенольно-хлороформной экстракции 25

2.2.2. Молекулярные методы 26

2.2.2.1. RealTime PCR (ПЦР в реальном времени) 26

2.2.2.2. Полимеразная цепная реакция 28

2.2.2.3. Полиморфизм длин рестрикционных фрагменов (ПДРФ) 29

2.2.2.4. Электрофорез в полиакриламидном геле 30

2.2.3. Статистические методы обработки данных 31

2.2.3.1. Программа SNPstats 31

2.2.3.2. Таблица сопряженности 2х2 33

2.2.4. Биоинформатические методы 34

2.2.4.1. Национальная база данных биотехнологической информации NCBI 34

2.2.4.2. Анализ межгенных взаимодействий 34

2.2.5. Метод дидактической многомерной технологии (логико-смысловое моделирование) 35

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 37

3.1. Анализ распределения частот генотипов и аллелей по полиморфному варианту rs6563 гена NOTCH1 37

3.1.1. SNP-анализ полиморфизма rs6563 гена NOTCH1 с помощью программы «SNPstats» 38

3.2. Анализ распределения частот генотипов и аллелей по полиморфному варианту rs7799039 гена LEP 39

3.2.1. SNP-анализ полиморфного варианта rs7799039 гена LEP 40

3.3. Анализ распределения генотипов и аллелей по полиморфному варианту rs373619077 гена CDK4 41

3.3.1. SNP-анализ полиморфного варианта rs373619077 гена CDK4 42

3.4. Анализ сочетаний генотипов полиморфных вариантов генов NOTCH1, LEP и CDK4 43

3.5. Биоинформатический анализ взаимодействия аллелей генов NOTCH1,

LEP и CDK4 50

ГЛАВА 4. МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ РЕЗУЛЬТАТОВ ВЫПУСКНОЙ КВАЛИФИКАЦИОННОЙ РАБОТЫ В ШКОЛЬНОМ КУРСЕ «БИОЛОГИЯ» 52

4.1. Применение материалов выпускной квалификационной работы в программе предмета «Биология» в средней школе 53

4.2. Разработка урока биологии в 9 классе на тему «Деление клетки. Митоз» 57

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 61

ВЫВОДЫ 62

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 64

ПРИЛОЖЕНИЕ 73

Введение

Актуальность. Онкология - многофакторное заболевание, которое поражает все органы и ткани человека и характеризуется неуправляемой, бесконтрольной клеточной пролиферацией, сопровождаемой ангиогенезом и миграцией клеток (Poehlmann, 2010).

Рак молочной железы является основной причиной смерти от рака среди женщин во всем мире. В России рак молочной железы является ведущей онкологической патологией у женского населения, и составляет 21,1% среди всех онкологических заболеваний у женщин (Каприн, 2018).

При раке молочной железы наблюдается повышенная экспрессия генов, отвечающих за рост и размножение клеток, образование новой сосудистой сети - ангиогнез. В публикациях последних лет особое внимание уделяется таким генам, как LEP, NOTCH1, CDK4, TP53, RB1 и др. (Gantsev, Gorbunova, 2013; Guo, 2013; Harbuzariu, 2017; Yang Zheng, 2018; Nagasundaram, 2015; Meiou, 2016).

Большое внимание уделяется роли генов LEP и NOTCH1, которые являются транскрипционными факторами и запускают сигнальные пути, регулирующие функционирование множества других генов (Zhou, 2011; Ranganathan, 2011; Guo, 2011, 2012, 2013; Harbuzariu, 2017; Yang Zheng, 2018). Ключевой, для развития онкологии, функцией обоих генов является регуляция клеточной пролиферации и активация ангиогенеза.

Также изучается роль функционирования генов - регуляторов клеточного цикла при онкопатологии. Основной упор делается на исследование циклинзависимой киназы 4 (Maimoona, 2012; Nagasundaram, 2015; Meiou, 2016). Этот белок запускает клеточный цикл. Его высокую экспрессию обнаруживают во многих типах рака, что дает надежду использовать этот ген в качестве мишени для терапии опухолей (Nagasundaram, 2015). Широко изучается возможность применения ингибиторов циклинзависимых киназ в качестве лекарственных средств (Charles, 2016).

Несмотря на большое число имеющихся публикаций, по-прежнему остается не ясным, что является первопричиной, запускающей каскад реакций, приводящих к развитию опухоли. Также, до сих пор не было показано, как взаимодействуют аллели генов, регулирующих различные сигнальные пути при онкологических заболеваниях.

Поэтому возникает необходимость исследования вклада протективных и непротективных аллелей генов LEP, NOTCH1 и CDK4 при развитии онкопатологии.

Целью исследования является изучение взаимодействия аллелей генов LEP, NOTCH1 и CDK4 при раке молочной железы и определение основного сигнального каскада, запускающего пролиферацию клеток, для использования в предиктивной и персонифицированной профилактике рака молочной железы.

Задачи исследования:

1. Генотипирование в группах с онкопатологией и контроля по полиморфным вариантам генов LEP, NOTCH1 и CDK4.

2. Статистический анализ распределения частот генотипов и аллелей по полиморфным вариантам rs7799039 гена LEP, rs6563 гена NOTCH1 и rs373619077 гена CDK4 в группе с онкопатологией и контроля.

3. Определение модели взаимодействия аллелей полиморфных вариантов генов LEP, NOTCH1 и CDK4.

4. Анализ межгенных взаимодействий генов LEP, NOTCH1 и CDK4.

5. Составление методических рекомендаций по использованию материалов ВКР в школьном курсе биологии.

Научная новизна: впервые показано, что взаимодействие

непротективных аллелей полиморфных вариантов генов LEP, NOTCH1 и CDK4 является сигнальным при развитии рака молочной железы.

Практическая значимость: выявленные ассоциации полиморфных вариантов генов LEP, NOTCH1 и CDK4 с риском развития онкопатологии могут считаться маркерами при формировании группы риска, а также использоваться при проведении персонифицированной профилактики развития онкологических заболеваний.

Апробация: результаты исследования были представлены на научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Вавиловские чтения - 2018» (Уфа, 2018).

По материалам исследования опубликованы две печатные работы в журналах входящих в базу данных РИНЦ:

1. Попова А.К., Воробьева Е.В., Горбунова В.Ю. Сравнительный анализ вклада частот аллелей и генотипов циклинзависимой киназы 4 (CDK4) в развитиие онкопатологии // Вавиловские чтения - 2018. Труды Межвузовской научной конференции молодых ученых. - Уфа: Изд-во БГПУ, 2018. - С. 55-58.

2. Горбунова В.Ю., Воробьева Е.В., Мухиярова И.И., Бакиев Р.Р., Николаев И.В., Попова А.К. Онкогенная роль сочетаний аллелей генов TP53, IL-1, LEP и CDK4 и их рецепторов // Сборник тезисов VII съезда ВОГиС, 2019.

Выпускная квалификационная работа выполнена в лаборатории Центра молекулярно-генетических исследований при кафедре генетики естественно-географического факультета Башкирского Государственного

Педагогического университета им. М. Акмуллы.

Выдержка из текста работы

ГЛАВА 1. МОЛЕКУЛЯРНЫЙ МЕХАНИЗМ КАНЦЕРОГЕНЕЗА ПРИ РАКЕ МОЛОЧНЫХ ЖЕЛЕЗ (ОБЗОР НАУЧНОЙ ЛИТЕРАТУРЫ)

Онкология - системное заболевание, которое захватывает все органы человека и характеризуется неуправляемым, безграничным размножением клеток (Poehlmann, 2010). Следовательно, мутации, приводящие к развитию онкологии, затрагивают системы регуляции клеточного цикла, апоптоза и дифференцировки клеток.

Канцерогенез — это постепенное накопление мутаций и других изменений, приводящих к активации протоонкогенов и инактивации генов- супрессоров в соматических клетках (Заридзе Д.Г., 2004; Carrassa L., 2013).

Одними из ключевых генов-супрессоров опухолевого роста являются гены TP53, BRCA1 и RB1, белковые продукты которых осуществляют реализацию широкого спектра клеточных процессов, регуляцию клеточного цикла, индукцию апоптоза, постоянный контроль за состоянием целостности генома и злокачественной трансформацией клеток (Копнин, 2000; Желтухин, 2010). Нарушение функциональной активности этих белков может провоцировать генетическую нестабильность, нарушение их

транскрипционной и сигнальной функций (Чумаков, 2007, Gantsev, Gorbunova, 2013).

Опухолевое перерождение может произойти в любой клетке, независимо от ее тканевой принадлежности и локализации.

Молочные железы (МЖ) - это видоизмененные потовые железы, являющиеся секреторным органом, продуцирующим грудное молоко. Состоит МЖ из множества различных типов клеток: эпителиальные клетки, которые располагаются в направлении от соска к подкожной жировой прослойке, образованной адипоцитами и инфильтрированной

эндотелиальными клетками сосудов, фибробластами и иммунными клетками (Oftedal, 2002).

Молочная железа - это уникальный динамически развивающийся орган, претерпевающий значительные анатомические и функциональные изменения в течение жизненного цикла (Inman, 2015).

Во время полового созревания сигналы индуктивного гормонального и ростового фактора стимулируют пролиферацию эктодермальных клеток, приводя к удлинению и ветвлению протоков МЖ (Hennighausen, 2001; Smalley, 2003; Moumen, 2011). Зрелый эпителий молочной железы продолжает подвергаться дальнейшей дифференциации на более поздних стадиях жизни, таких как беременность, лактация и послеродовая инволюция, или эпителиальная регрессия (Smalley, 2003; Dontu, 2015). Окончательное развитие МЖ происходит после первой беременности и лактации (Трошина, 2012).

Молочная железа человека является сложной разветвляющейся структурой. Начиная с соска, молочный синус впадает в сегментные или междольковые протоки, расположенные между дольками МЖ. В свою очередь, дольки МЖ окружены междольковой стромой - подкожной жировой тканью, составляющей от 7% до 56% объема взрослой груди (Vandeweyer, 2002).

При раке молочной железы наблюдается самый экстремальный пример инфильтрации опухоли в жировую ткань. Рак молочной железы чаще всего начинается в проточных эпителиальных клетках, которые размножаются, заполняя просвет протоков и создавая предраковое поражение, называемое протоковой карциномой in situ. Впоследствии клетки инвазивной протоковой карциномы вторгаются в клетки стромальной ткани молочной железы, сталкиваясь с областью, богатой жировой тканью (Cozzo, 2017).

С другой стороны, примерно 1 из 10 инвазивных раковых опухолей молочной железы возникает в дольках, и прогрессирует до инвазивной дольковой карциномы. В таком случае клетки инвазивной карциномы молочной железы должны мигрировать через внутри- и междольковую строму, прежде чем непосредственно встретить жировую ткань (Cozzo, 2017).

Адипоциты жировой ткани могут проявлять как короткое, так и длительное взаимодействие с раковыми клетками, и могут находиться в непосредственной близости от опухолей, вдоль краев опухоли или внутри опухолевого тела. Такие ассоциированные с раком адипоциты (CAAs, также называемые перитуморальными, интратуральными или

опухолеинфильтрационными адипоцитами) влияют на биологию опухоли несколькими способами, в том числе путем усиления процессов ангиогенеза и воспаления (Wang, 2012; Nieman, 2013; Wagner,2013).

Заключение

Данная работа посвящена изучению взаимодействия аллелей полиморфных вариантов генов NOTCH1, LEP и CDK4. В ходе исследования в группах с РМЖ и контроля были получены достоверные ассоциации с развитием онкологии по каждому из изучаемых генов.

С помощью таблицы сопряженности 2х2 рассчитывали и сравнивали частоты аллелей и генотипов в исследуемых группах, модель взаимодействия аллелей определяли с помощью программы «SNPstats». Достоверная модель взаимодействия аллелей для каждого полиморфизма определялась по наименьшему критерию Акаике (AIC) и по значению р<0,05.

Анализ межгенных взаимодействий осуществлялся методом построения метаболических путей с помощью программ «GENEmania» и «STRING-DB». Установлено, что взаимодействие белковых продуктов изучаемых генов осуществляется в направлении LEP - NOTCH1 - CDK4. Это объясняется тем, что лептин, являясь транскрипционным фактором и регулятором сигнальных каскадов, индуцирует экспрессию Notch1, что приводит к активации сигнального пути Notch1, одним из ключевых генов- мишеней которого является CDK4.

Таким образом, достоверно установлено, что мутации в генах NOTCH1, LEP и CDK4 ассоциированы с развитием РМЖ, а взаимодействие непротективных аллелей увеличивает риск развития онкопатологии.

Список литературы

1. Агафонова И.Б., Сивоглазов В.И. Программа среднего (полного) общего образования. Биология. Общая биология. 10-11 классы. Базовый уровень. - М.: Дрофа, 2013 - 222 с.

2. Желтухин А.О., Чумаков П.М. Повседневные и индуцируемые функции гена р53. М: Успехи биологической химии, 2010. - Т.50. - С.447516.

3. Заридзе Д.Г. Канцерогенез: руководство для врачей // Под ред. Д.Г. Заридзе. - М.: Медицина, 2004. - 576с. - ISBN 5-225-04787-4

4. Каменский А.А. Биология. Введение в общую биологию и экологию: Учеб. для 9 кл. общеобразоват. учеб. заведений / А.А. Каменский, Е.А. Криксунов, В.В. Пасечник. - 3-е изд., стереотип. - М.: Дрофа, 2002. - 304 с.

5. Каприн А.Д., Старинский В.В., Петрова Г.В. Злокачественные новообразования в России в 2017 году (заболеваемость и смертность). - М.: МНИОИ им. П.А. Герцена - филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, - 2018. - илл. - 250 с. ISBN 978-5-85502-243-8

+ еще 85 источников

Примечания

Оригинал в pdf