«Изучение полиморфизма генов регуляции клеточного цикла p21 и сdk2 в норме и при онкопатологии»

Таким образом, при исследовании механизмов злокачественной трансформации клеток наиболее значимым является изучение генов регуляции клеточного цикла, таких как р21 и CDK2 ввиду их многофункциональности.

Цель настоящего исследования заключается в анализе аллельных состояний генов клеточного цикла р21 и CDK2 в норме и при онкопатологии.

Исходя из цели были поставлены следующие задачи:

1. Провести генотипирование по полиморфным локусам rs1801270 (C/A) гена р21 и rs3087335 (А/С) гена CDK2 в группе здоровых индивидов и онкобольных с различной локализацией опухоли;

2. Провести анализ генетической структуры популяции по полиморфным локусам генов p21 и CDK2 у здоровых индивидов и онкобольных

3. Оценить роль межгенных взаимодействий трех полиморфных локусов генов p21, CDK2 и ATM в развитии онкопатологии;

4. Провести анализ наследования аллелей изучаемых генов в семье с онкологическим анамнезом;

5. Смоделировать структуры белков p21, CDK2 и ATM с использованием компьютерных программ;

6. Разработать методические рекомендаций по применению теоретического и экспериментального материала выпускной квалификационной работы в школьном курсе биологии.

Научная новизна исследования: было установлено, что рисковыми сочетаниями генотипов являются: СС/АА/GA, СС/АА/AА; по полиморфным локусам rs1801270 (C/A) гена р21, rs3087335 (А/С) гена CDK2 и по полиморфному локусу rs1801516 (G/A) гена АТМ соответственно, имеющие прогностическую значимость. Определены межгенные взаимодействия полиморфных локусов в генах р21 rs1801270 (C/A), CDK2 rs3087335 (А/С) и АТМ rs1801516 (G/A). Впервые проведен семейный анализ по генам р21, CDK2 и АТМ семьей с различным онкологическим анамнезом. Смоделированы пространственные структуры белков p21, CDK2 и ATM с использованием компьютерных программ.

Практическая значимость. Полученные данные вносят вклад в понимание роли мутаций в генах клеточного цикла, определяющих онкогенез, и играют важную роль в практической деятельности для определения генетической предрасположенности к развитию онкопатологии. Материалы работы могут быть использованы при изучении студентами особенностей регуляции клеточного цикла.

В процессе подготовки клетки к делению и образования в дальнейшем из нее двух новых клеток отмечается несколько фаз: G1 фаза, в которой происходит подготовка к синтезу ДНК; S фаза - это период репликации ДНК; G2 фаза – подготовка к митозу; и митоз – процесс разделения клетки на 2 новые. Образовавшиеся дочерние клетки могут сразу же войти в новый цикл митоза, или на некоторое время выйти из него в стадию покоя – G0 фазу. Двигателем клеточного цикла является активация последовательно сменяющих друг друга циклинзависимых киназ (рис.1). Каждая из циклинзависмых киназ представляет собой небелковый компонент связанный с белком. Этот холоферментный комплекс состоит из каталитической субъединицы (сdk) и регуляторной субединицы (циклин). Связывание с циклином увеличивает киназную активность сdk и определяет их расположение и субстратную специфичность. Уровень экспрессии каждого из циклинов и в меньшей степени сdk нацелено изменяется в определенные фазы клеточного цикла. Итак, выход клетки из состояния покоя G0 фаза и вход в фазу G1 определяется образованием комплексов циклинов D (D1-D3) с CDK4 или CDK6 (в соответствии от типа клеток). Переход из G1 фазы в фазу S связан с образованием комплексов циклина Е CDK2 (Заридзе с соавт., 2004).

Рис. 1: Общие принципы регуляции клеточного цикла в нормальной клетке

(Заридзе с соавт., 2004).

Помимо связывания с циклинами, активность сdk регулируется изменениями фосфорилирования их установленных аминокислотных остатков и связыванием с ингибиторами сdk (Заридзе с соавт., 2004). В Таблице 1 представлены основные циклин/ циклин-зависимый киназный комплексы позвоночных, специфичные для той или иной фазы (Мушкамбаров, 2007).

Таблица 1

Регуляция клеточного цикла

G1 период Циклин D/CDK4/6

переход из G1 в S период Циклин E/CDK2

S период Циклин A/CDK2

переход из S в G2 период Циклин А/CDK1

переход из G2 периода в митоз (М период) Циклин B/CDK1

Циклин H + CDK7 необходим для фосфорилирования и активациии

Циклин B/CDK1 + Циклин D/CDK4

Белки второго семейства CKI - важные регуляторы активности CDK. Они необходимы для нормального хода клеточного цикла. Это семейство состоит из трех членов - p21, p27 и p57, данные белки связывают и ингибируют уже полностью сформированные комплексы циклин D/CDK 4/6, циклин E/CDK2 и циклин А/CDK2 (Golias, 2004). Кроме того, p21 блокирует и комплекс циклин B/CDK1, ответственный за прохождение по G2-фазе и вход в митоз (рис.2). И p21, и p27 опосредуют влияние других супрессорных белков. Так же, p21 является одной из мишеней трансактивационного действия р53, а следовательно, и супрессоров, участвующих в регуляции стабильности или активности р53 (Hirao, 2000) или же его транскрипционной активности (Lee,2000;Bell,1999).

Рис. 2: Эндогенные регуляторы клеточного цикла (Heuvel, 2005).

В нормальных клетках р21 входит в состав комплекса, который состоит из циклина, циклин-зависимой киназы и ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA). Возможно, что р21 нужен для сборки активного киназного комплекса. Отсюда следует, что повышение уровня р21 под действием р53 приводит к ингибированию cdk-комплекса. (Zhang et al.,1994). Кроме того, p21 обеспечивает защиту клетки от апоптоза, то есть в зависимости от условий р21 может выступать в роли антионкогена или онкогена. Ген р21 обычно не инактивируется полностью в злокачественных новообразованиях. Точная роль p21 в онкогенезе до конца пока не обнаружена. Однако, известны ситуации, когда повышенная концентрация белка р21 в клетках положительно коррелирует с агрессивностью опухоли и её способностью к метастазированию. Это особенно относится к тем случаям, когда p21 накапливается в цитоплазме, а не в ядре клетки (Warfel N.A., El-Deiry W.S., 2013).

Активированная форма ATM фосфорилирует ряд своих мишеней, в частности р53, BRCA1, Mre11, CHK1, CHK2 и NBS1(рис.3). АТМ принимает участие в инициации механизмов, необходимых для поддержания целостности генома клетки, что делает его одним из важнейших белков-регуляторов клеточного цикла (Jameson et al, 2003).

Рис.3: Схема сигнальных путей, регулирующих реакции клетки на повреждения ДНК (Копнин, 2005).

1.1. Структура и локализация генов р21,СDK2 и ATM

1.1.3. Структура и локализация гена р21

Ген р21 или известный также как дикий тип активированного фрагмента – WAF1 (wild-type activated factor), или ингибитор циклинзависимой киназы 1А CDKN1A (cyclin-dependent kinase inhibitor 1A) или CIP1 (CDK- interacting protein) локализован на коротком плече 6 хромосомы (6p21.2), состоит из 10880 пар оснований (рис.4). Данный ген содержит 5 экзонов (рис.5); первый экзон кодирует нетранслируемую область (www.genecards.org ).

Рис.4: Локализация гена р21 на хромосоме ( www.genecards.org ).

Рис.5: Структура гена р21 ( www.ncbi.nlm.nih.gov ).

1.1.2. Структура и локализация гена СDK2

Ген циклинзависимой кинзы 2, cyclin-dependent kinase 2 (СDK2) расположен на длинном плече 12 хромосомы, (рис.6), содержит 7 экзонов (рис. 7). Ген состоит из 6016 пар оснований.

Исследования механизмов регуляции клеточного цикла онкогенами позволят глубже понять взаимодействие систем стимуляции пролиферации и защитных систем клетки, что необходимо для понимания механизмов канцерогенеза, поскольку нарушение этих взаимодействий является важнейшим этапом опухолевой прогрессии.

Таким образом, полученные результаты позволяют говорить о ключевой роли аллельных состояний генов клеточного цикла, таких как р21, СDK2 и ATM, в формировании риска развития онкопатологии.

ВЫВОДЫ

1. В группе здоровых индивидов выявлено достоверное повышение частоты генотипа СС и аллеля *С по полиморфному локусу rs1801270 (C/А) гена р21; генотипов АА и аллеля *А по полиморфному локусу rs3087335 (А/С) гена CDK21 по сравнению с группой онкобольных; генотипов GG и аллеля *G по полиморфному локусу rs1801516 (G/А) гена ATM;

2. В группе онкобольных выявлено достоверное повышение частоты генотипа АА и аллеля *А по полиморфному локусу rs1801270 (C/А) гена р21; генотипов СС и аллеля *С по полиморфному локусу rs3087335 (А/С) гена CDK2 по сравнению с группой здоровых индивидов; генотипов АА и аллеля *А по полиморфному локусу rs1801516 (G/А) гена ATM;

3. Рисковыми сочетаниями генотипов являются: СС/АА/GA, СС/АА/AА; по полиморфным локусам генов р21, CDK2 и АТМ соответственно, сочетающие не более двух рисковых аллелей и имеющие прогностическую значимость;

4. Установлена достоверная трехлокусная модель межгенных взаимодействий, детерминирующая развитие онкологических заболеваний. Причем гены р21, CDK2 и АТМ вносят независимый друг от друга вклад на формирование риска развития онкопатологии;

5. Проведен генеалогический анализ наследования аллелей генов р21, CDK2 и АТМ в семьях с различным онкологическим анамнезом;

6. С использованием компьютерных программ смоделированы белковые молекулы (р21, CDK2 и АТМ);

7. Разработаны методические рекомендации по применению теоретического и экспериментального материала выпускной квалификационной работы в школьном курсе биологии.

7) Измайлов А.А. Факторы риска развития, прогноза и выбор тактики лечения рака мочевого пузыря // Автореферат на соискание ученой степени доктора медицинских наук. БГМУ, Уфа, 2014.

8) Клаг У., Каммингс М. Контроль клеточного цикла// Основы генетики - М: Техносфера, 2009 - С.58-59.

9) Колесов Д.В., Маш Р.Д.,Беляев И.Н Биология. Человек 8 класс: учебник- М: Дрофа,2007

10) Коничев А.С., Севастьянова Г.А. Молекулярная биология// Учебник для студентов педагогических вузов, 2 издание, Москва, 2005.

11) Копнин Б.П. Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров: ключ к пониманию базовых механизмов канцерогенеза// Биохимия, 2000.

12) Копнин Б.П. Опухолевые супрессоры и мутаторные гены// Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва, 2005.

13) Курчанов Н.А. Генетика человека с основами общей генетики // СпецЛит. 2009.

14) Михайлова В.А. Учебно-методический комплекс по дисциплине «Теория и методика биологического образования», Стерлитамак, 2008.

15) Суханова М.В., Лаврик О.И., Ходырева С.Н. Поли(ADP-рибозо) полимераза 1 – регулятор белково-нуклеиновых взаимодействий в процессах, возникающих при генотоксическом воздействии // Молекулярная биология. – 2004. – Т.38, №5. С.834-847.

16) Сытенкова К.В., Н.И. Поспехова, И.В. Поддубная, Л.Н. Клинические особенности различных генотипических вариантов при наследственном и спорадическом раке молочной железы// Российский биотерапевтический журнал, 2011.

17) Пасечник В. В. Биология. Бактерии, грибы, растения. 5 класс: учебник. — М.: Дрофа,

18) Пасечник В. В. Биология. Многообразие покрытосеменных растений. 6 класс: учебник. — М.: Дрофа,

19) Латюшин В. В., Шапкин В. А. Биология. Животные. 7 класс: учебник. — М.: Дрофа,

20) Каменский А. А., Криксунов Е. А., Пасечник В. В., Швецов Г. Г. Биология. Введение в общую биологию. 9 класс: учебник. — М.: Дрофа,

21) Каменский А. А., Криксунов Е. А., Пасечник В. В. Биология. Общая биология. 10-11 классы: учебник. — М.: Дрофа

22) Татосян А.Г., Онкогены // Сборник обзорных статей «Канцерогенез», под ред. Д.Г. Заридзе. - М: Научн. Мир, 2000. - С. 57-74.

23) Финкельштейн А.В. Птицын О.Б. Физика белка // Курс лекций светными и стереоскопическими иллюстрациями, 2 издание, Москва, 2002.

24) Ченцов Ю.С. Введение в клеточную биологию - ИКЦ «Академкнига»,2005.

25) Чумаков П.М. Белок Р53 и его универсальные функции в многоклеточном организме// Успехи биологической химии. Т.47. 2007

26) Штейнберг В.Э. Дидактические многомерные инструменты: теория, методика, практика. – Москва: Народное образование, 2002.

27) Abbas T, Dutta A. p21 in cancer: intricate networks and multiple activities. Nature Reviews of Cancer 2009;9(6) 400-414.

28) Abelev G.I and Eraiser T.L(1999)Semin.cancer Biol.9,95-107.

29) Blana J., Altman D. The odds ratio // British Medical Journal. 2000. V.320.

30) Balomenos D, Martìn-Caballero J, Garcìa MI, Prieto I, Flores JM, Serrano M, Martinez-AC. The cell cycle inhibitor p21 controls T-cell proliferation and sex-linked lupus development. Nature Medicine 2000;6(2) 171-176.

31) Baynes C., Healey C.S., Pooley K.A., Scollen S., Luben R.N. Common variants in the ATM, BRCA1, BRCA2, CHEK2 and TP53 cancer susceptibility genes are unlikely to increase breast cancer risk, 2007.

32) Bohgaki Toshiyuki, Bohgaki Miyuki, Razqallah Hakem. DNA double-strand break signaling and human disorders. Genome Integrity, 5 November, 2010.

33) Cazzalini O, Scovassi AI, Savio M, Stivala LA, Prosperi E. Multiple roles of the cell cycle inhibitor p21CDKN1A in the DNA damage response. Mutation Research/Reviews in Mutation Research 2010;704(1-3) 12-20.

34) Chopin V, Toillon RA, Jouy N, Le Bourhis X. P21(WAF1/CIP1) is dispensable for G1 arrest, but indispensable for apoptosis induced by sodium butyrate in MCF-7 breast cancer cells. Oncogene 2004;23(1) 21-29.

35) Deng G, Zhang P, Harper JW, Elledge SJ, Leder P. Mice lacking p21CIP1/WAF1 undergo normal development, but are defective in G1 checkpoint control. Cell 1995;82(4) 675-684.

36) Devgan V, Mammucari C, Millar SE, Brisken C, Dotto GP. p21WAF1/Cip1 is a negative transcriptional regulator of Wnt4 expression downstream of Notch1 activation. Genes & Development 2005;19(12) 1485-1495.

37) E Cavaciuti,A K d'Almeida M-G Dondon,A Laugé,N Janin, D Stoppa-Lyonnet, and N Andrieu.Br J Cancer. Sep 19, 2005; 93(6): 730–732.

38) Gartel AL, Tyner AL. The role of the cyclin-dependent kinase inhibitor p21 in apoptosis.Molecular Cancer Therapeutics 2002;1(8) 639-649.

39) Gervais JL, Seth P, Zhang H. Cleavage of CDK inhibitor p21(Cip1/Waf1) by caspases is an early event during DNA damage-induced apoptosis. The Journal of Biological Chemistry 1998;273(30) 19207-19212.

40) Gibbs,P.E.Wilke,W.F. and Dugaiczyk,A(1998) J.Mol.Evol.,46,5762-5768.

41) Harper JW1, Adami GR, Wei N, Keyomarsi K, Elledge SJ.The p21 Cdk-interacting protein Cip1 is a potent inhibitor of G1 cyclin-dependent kinases. Cell. 1993 Nov 19;75(4):805-16.

42) Jameson C.W., Ruth M. Lunn, Shawn Jeter, AnnaLee Sabella «Report on Carcinogens Background Document for X Radiation & Gamma Radiation and Neutrons» June 18, 2003.

43) Kitaura H, Shinshi M, Uchikoshi Y, Ono T, Iguchi-Ariga SM, Ariga H. Reciprocal regulation via protein–protein interaction between c-Myc and p21(cip1/waf1/ sdi1) in DNA replication and transcription. The Journal of Biological Chemistry 2000;275(14) 10477-10483.

44) Kitaura H, Shinshi M, Uchikoshi Y, Ono T, Iguchi-Ariga SM, Ariga H. Reciprocal regulation via protein–protein interaction between c-Myc and p21(cip1/waf1/ sdi1) in DNA replication and transcription. The Journal of Biological Chemistry 2000;275(14) 10477-10483.

45) Lavin, M.F. and Shiloh, Y. Lavin, M.F. and (1997) The genetic defect in ataxia-telangiectasia. Annu. Rev. Immunol., 15, 177–202.

46) Lea M Starita and Jeffrey D Parvin. The multiple nuclear functions of BRCA1: transcription, ubiquitination and DNA repair// Current Opinion in Cell Biology 2003.

47) Liu S, Bishop WR, Liu M. Differential effects of cell cycle regulatory protein p21(WAF1/Cip1) on apoptosis and sensitivity to cancer chemotherapy. Drug Resistance Updates 2003;6(4) 183-195.

48) Maillet P, Vaudan G, Chappuis P, Sappino AP. PCR-mediated detection of a polymorphism in the ATM gene. Moll Cell Probes 1999; 13:67–9.

49) Maillet P, Vaudan G, Chappuis P, Sappino AP. PCR-mediated detection of a polymorphism in the ATM gene. Moll Cell Probes 1999; 13:67–9.

50) Mammalian G1- and S-phase checkpoints in response to DNA damage.Curr Opin Cell Biol. 2001 Dec;13(6):738-47.

51) Martin-Caballero J, Flores JM, Garcìa-Palencia P, Serrano M. Tumour susceptibility of p21waf1/cip1-deficient mice. Cancer Research 2001;61(16) 6234-6238.

52) Morgan, D.O. (1997) Annu.Rev.Cell Dev. Biol., 13, 261-291.

53) Mousses S, Ozcelik H, Lee PD, Malkin D, Bull SB, Andrulis IL. Two variants of the CIP1/WAF1 gene occur together and are associated with human cancer. Hum Mol Genet. 1995; 4: 1089 – 1092.

54) Perkins ND. Not just a CDK inhibitor: regulation of transcription by p21(WAF1/ CIP1/SDI1). Cell Cycle 2002;1(1) 39-41.

55) Rastinejad F, Blau HM. Genetic complementation reveals a novel regulatory role for 3’ untranslated regions in growth and differentiation. Cell. 1993; 72: 903 – 917.

56) Redeuilh G, Attia A, Mester J, Sabbah M. Transcriptional activation by the estrogen receptor alpha is modulated through inhibition of cyclin-dependent kinases. Oncogene 2002;21(37) 5773-5782.

57) Rodríguez-Vilarrupla A, Díaz C, Canela N, Rahn HP, Bachs O, Agell N. Identification of the nuclear localization signal of p21(cip1) and consequences of its mutation on cell proliferation. FEBSLetters 2002;531(2) 319-323.

58) Rubbi CP, Milner J. p53 is a chromatin accessibility factor for nucleotide excision repair of DNA damage. The EMBO Journal 2003;22(4) 975-986.

59) Savinsky K, Bar-Shira A, Gilad S, et al. A single ataxia-telangiectasia gene with a product similar to PI-3 kinase. Science 1995; 268:1749–53.

60) Sherr, C.J. (1998) Genes Dev., 12, 2984-2991.

61) Smits VA, Klompmaker R, Vallenius T, Rijksen G, Makela TP, Medema RH. p21 inhibits Thr161 phosphorylation of Cdc2 to enforce the G2 DNA damage checkpoint. The Journal of Biological Chemistry 2000;275(39) 30638-30643.

62) Sohn D, Essmann F, Schulze-Osthoff K, Janicke RU. p21 blocks irradiation induced apoptosis downstream of mitochondria by inhibition of cyclin-dependent kinase-mediated caspase-9 activation. Cancer Research 2006;66(23) 11254-11262.

63) Soussi T (2011) TP53 Mutations in Human Cancer: Database Reassessment and Prospects for the Next Decade. Adv Cancer Res 110: 107-139.

64) Teraoka SN, Telatar M, Becker-Catania S, et al. Splicing defects in the ataxiatelangiectasia gene, ATM: Underlying mutations and consequences. Am J HumGenet 1999; 64:1617–31.

65) Thomas R., Philip G. G., Sharon M. K. et al. A polymorphism at codon 31 of gene p21 is not associated with primary open angle glaucoma in Caucasians // Exp. EyeRes. - 2005. - Vol.22. - P. 8493-8500.

66) Tichý A, Vávrová J, Pejchal J, Řezáčová M. Ataxia-telangiectasia mutated kinase(ATM) as a central regulator of radiation-induced DNA damage response. ActaMedica 2010; 53:13–7.

67) Viale A, De Franco F, Orleth A, Cambiaghi V, Giuliani V, Bossi D, Ronchini C, Ronzoni S, Muradore I, Monestiroli S, Gobbi A, Alcalay M, Minucci S, Pelicci PG. Cell-cycle restriction limits DNA damage and maintains self-renewal of leukaemia stem cells. Nature 2009;45(7225) 751-756.

68) Zhang, H., Somasundaram, K., Peng, Y., Tian, H., Zhang, H., Bi, D., Weber, B.L., and El-Deiry, W.S. (1998) Oncogene, 16, 1713-1721.

69) Биоинформатическая база данных The National Center for Biotechnology Information (NCBI) [Электронный ресурс] / Режим доступа: h**p://ww**cbi.nlm.nih.gov/, свободный. — Загл. с экрана. — Яз. англ.

70) Генетическая база данных GeneCards [Электронный ресурс] / Режим доступа: h**p://ww**necards.org/, свободный. — Загл. с экрана. — Яз. англ.

71) База данных по белкам «Universal Protein Resource» (UniProt) [Электронный ресурс] / Режим доступа: h**p://un**ot.org/, свободный. — Загл.с экрана. — Яз. англ.

72) База данных по белкам «Protein Data Bank» (PDB) [Электронный ресурс] / Режим доступа: ; h**p://p**rg/ , свободный. — Загл. с экрана. — Яз. англ.

73) Онлайн программа для моделирования 3D струтур белков «SWISS-MODEL» [Электронный ресурс] / Режим доступа: h**p://swi***del.expasy.org/, свободный. — Загл.с экрана. — Яз. англ.