«Нобелевская премия в области физиологии и медицины «За открытие способности вируса полиомиелита расти в культурах различных тканей» Джон Ф.Эндерс ,Фредерик Ч.Роббинс,Томас Х.Уэллер(1954)»

Выращивание вирусов в культурах клеток дало возможность получения чистого вирусного материала для производства вакцин. Вакцина против полиомиелита стала одним из первых препаратов, массово произведенных с использованием технологии культивирования клеток.

Эндерс и его коллеги сумели размножить полиовирус в клеточной ткани, причем не только в нервной, но и в мышечной, а также в ткани кишечника. Это открытие имело огромное значение, потому что позже было доказано, что вирус, выращенный не в нервной ткани, теряет губительную для человека силу, но сохраняет все качества, необходимые для приготовления вакцины.

Две страницы первой, ставшей исторической, статьи о полиовирусе, написанной Эндерсом и его коллегами, привели в восторг почти восьмидесятилетнего Росса Гаррисона. Спустя сорок лет после его монументального открытия, именно благодаря ему, будет создана вакцина, способная предотвратить эпидемии таких страшных вирусных заболеваний, как полиомиелит, корь, паротит, коклюш и ветряная оспа! В 1953 году группа Джонаса Солка сообщила о защитных свойствах вакцины, состоящей из частиц инактивированного вируса полиомиелита, полученных путем выращивания в культуре тканей по методу, изобретенному четырьмя годами ранее Эндерсом и его коллегами

Целью данной курсовой работы является изучение эксперимента по открытию способности вируса полиомиелита расти в культурах различных тканей.

Задачи:

1. Изучить биографию Джона Ф. Эндерса, Фредерика Ч. Роббинса и Томаса Х. Уэллера

2. Изучить методы выращивания вирусов полиомиелита в культурах тканей

3. Составить схему эксперимента по способности вируса полиомиелита расти в культуре человеческой ткани.

В 1941 г. в Медицинской школе Гарварда были сделаны дальнейшие открытия, подтолкнувшие к изучению поведения вируса лошадиного энцефалита, вируса простого герпеса, вируса гриппа и ветряной оспы в роллерных культурах независимо доктором Уэллером и Л. Кинг- Сландом в детском госпитале Бостона. После войны доктора Эндерса попросили создать лабораторию при детской больнице для изучения инфекционных заболеваний. Доктор Уэллер принял участие в создании лаборатории. Скоро к ним присоединился и доктор Роббинс. Первый эксперимент был выполнен в новой лаборатории в апреле 1947 г.

Исследование возможностей тканевых культур для размножения вирусов было возобновлено, и в лаборатории был выделен вирус эндемического паротита. Вскоре стало ясно, что вирусы легко растут в простой взвеси клеток, состоящей из фрагментов амниотической мембраны цыпленка, обогащенной сбалансированным солевым раствором и ультрафильтратом бычьей сыворотки [2]. Нарастание количества вирусов легко отслеживалось измерением количества гемагглютинина, который образовывался в жидкой культуре после введения небольшого количества возбудителей. Не перемещая материал из одной культуры в другую каждые 3-4 дня, как это было в более ранних исследованиях, ученые сохраняли ткани во время замены питательной среды. Таким образом, жизнеспособность клеток поддерживалась в течение 30 дней и дольше, что давало вирусам возможность расти в течение того времени, когда разведенная субстанция, содержащая вирус, была эффективна.

В 1948 г., когда работа была завершена, ученые не собирались сразу ставить опыты с вирусом полиомиелита. Время от времени они обсуждали выводы Грина и Эванса о том, что эти возбудители не могут быть строго нейротропными. Трудно было представить, что огромное количество вирусов, обнаруживаемых в фекалиях пациентов, образуется в нервной системе. Именно это повлияло на решение использовать взвесь из клеток кожи и мышечной ткани человеческого эмбриона в надежде, что вирус ветряной оспы сможет размножаться в клетках естественного носителя. Культуры были подготовлены, а в кабинете хранился штамм вируса полиомиелита Лансинга. После этого они поняли, что почти без осознанных усилий подготовились к новой попытке культивирования вируса вне нервной ткани.

Глава III История эксперимента

3.1. Демонстрация размножения вирусов полиомиелита вне нервной ткани

Чтобы продемонстрировать жизнеспособность полиовируса, исследователи ввели мышам культуральную среду. Мыши заболели полиомиелитом. Поскольку метод определения наличия вируса в культуре ткани был длительным и дорогостоящим, они попытались разработать другой, более пригодный. Уэллер и его коллеги обнаружили, что можно следить за ростом вируса по его повреждающему воздействию на клетки, исследуя их под микроскопом или наблюдая за изменением кислотности культуральной жидкости, вызываемым разрушением клеток.

Уэллер, Эндерс и Роббинс исходно имели клетки, растущие в суспензии, но они знали, что их можно культивировать на твердом слое во флаконах, постоянно вращающихся для сохранения нормального одинакового питания для клеток. При инфицировании таких культур полиовирусами можно непосредственно наблюдать поврежденные клетки. Вместо того, чтобы ждать две недели, пока поврежденные под влиянием вируса клетки изменят кислотность культуральной среды, или изолировать зараженные клетки из клеточной суспензии, а затем выращивать их, они получали аналогичные результаты в течение трех – пяти дней после заражения клеток вирусами.

Вирус, содержащийся в инфицированной суспензии мозга мыши, был введен в культуры человеческой ткани. После введения мыши частиц исходной культуры и полученных из последовательных серий пассажей in vitro стало очевидно, что вирус размножается. Введение жидкости из третьего пассажа в мозг обезьяны сопровождалось появлением типичного вялого паралича ног [3]. Эти открытия, на фоне неудачных попыток наших предшественников, не оставили возможности для сомнения.

Увеличение содержания вируса Лансинга в данной культуре тканей отражено на рис. 1. Эти результаты были получены титрованием каждые четыре дня смешанных жидкостей, полученных из четырех культур, в каждую из которых было введено одинаковое количество зараженного мышиного мозга. Верхняя кривая отражает отрицательный логарифм значений мышиных титров, нижняя — посчитанное количество вирусов, возникающее в жидкости каждые 4 дня, выраженное в LD50/мл на мышь. Очевидно, что в этих условиях значимое количество вируса появляется только после восьми дней, а максимум возникает между 12-м и 16-м днями.

Рис.1. Заражение мышей порциями жидкости, взятой с четырехдневными интервалами из суспензированной клеточной культуры кожи и мышц человеческого эмбриона, зараженной вирусом Лансинга, полученного из мозга мыши (Из J. Immun., 69(1952) 652)

Вскоре эти открытия были подтверждены и исследования продолжены.

Так как ткань, используемая в эксперименте,была взята с конечностей, то в ней не было интактных нервных клеток, таким образом, рост вируса происходил на клетках других тканей. Это заключение было многократно подтверждено прямыми исследованиями действия вируса на разные типы клеток. Стало очевидно, что хотя бы in vitro вирусы полиомиелита не строго нейротропны.

В течение начального периода исследования рост штаммов вируса был продемонстрирован на суспензированной культуре клеток многих тканей человеческого эмбриона: кишечника, печени, почек, надпочечников, сердца, селезенки и легких.Подтверждая результаты Сабина и Олицки [8], опубликованные в 1936 г., рост вируса наблюдался и в культурах мозга эмбриона. Позднее, при применении роллерной техники культивирования этих возбудителей, было показано, что увеличение числа вирусов происходит быстрее и достигает больших значений по сравнению с данными на рис.1.

Кривые на рис. 2 иллюстрируют эту разницу.

Рис. 2. Размножение вируса Лансинга в роллерных культурах мышечно-кожной ткани человеческого эмбриона, инокулированных в два этапа после их приготовления. Титрование инфекционности мышей порциями жидкости, взятой через различное количество дней после инокуляции. (Из J. Immunol., 69 (1952) 689)

Данные на рис. 2 были получены из титрования на мышах жидкости, полученной из роллерных культур кожи и мышц человеческого эмбриона, зараженных вирусом Лансинга. Стоит отметить, что максимальная концентрация вирусов, достигаемая в жидкой культуре тканей, равна или превышает значения для нервной системы инфицированных мышей.

3.2.Цитопатогенное действие вируса полиомиелита

Описанные результаты имеют фундаментальное значение, так как указывают, что три известных антигенных типа вируса полиомиелита могут быть без труда выращены на различных человеческих клетках. Однако значение этого исследования для дальнейшего изучения этих частиц как с биологической, так и с практической точек зрения сильно ограничено отсутствием ясного индикатора размножения вирусов в самой культуре ткани. Возможно, что если бы оставалась необходимость заражать подопытных животных для подтверждения наличия вируса в культуре, метод мог бы быть широко использован как удобный способ подготовки вирусных суспензий.

К счастью, признаки вирусной активности в культуре наблюдаются сразу после начала размножения вируса. Исследование окрашенных срезов участков кишечника, кожи и мышц человеческого эмбриона, ранее подвергшихся воздействию штамма Лансинга, выявило распространенную деградацию клеток. Напротив, в незараженных тканях, находящихся в тех же условиях, клетки были в превосходном состоянии. Последующее изучение действия вирусов I и II типов в данной ткани и в культурах кишечника и мозга эмбриона убедило в том, что после продолжительного периода (от 16 до 32 дней) рост вирусов приводит к гибели клетки и ее разрушению. По крайней мере, вирус воздействует на фибробласты и клетки эпителия.

Примерно в то самое время, когда наблюдалось «цитопатогеное», воздействие вируса, ученые выявили косвенное проявление повреждения клеток. Оно заключалось в снижении скорости обмена веществ в тканях, инфицированных вирусом, и выражалось прогрессивным алкалозом. Это явление было просто продемонстрировано путем сравнения отклонений pH от средних значений в инфицированных культурах и в контрольных, не содержащих вирус.

Эксперимент показал взаимосвязь между высокими значениями pH и наличием вируса в жидкой культуре. С установлением этой связи стало возможно применение метода титрования инфективности для культур тканей с введенной суспензией вируса (аналогично используются подопытные животные). На рис. 3 показаны результаты титрования вирусом Лансинга, выращенным в тканевой культуре. Это является примером того, как непрямое определение цитопатогенности вируса может быть использовано для определения минимального количества вирусов, способных размножаться во взвеси клеточных культур, полученных из фрагментов мозга человеческого эмбриона. На этом примере видно, что даже разбавленное в 10 раз вещество способно ингибировать клеточный метаболизм. Впоследствии Родес и его коллеги показали, что уменьшение продукции кислот связано с постепенным уменьшением потребления глюкозы.

Полиомиелит был “побежден” благодаря вакцине, созданной из чистого вирусного материала, полученного методом культивирования. Во многих вирусологических исследованиях культура тканей стала теперь подходящей заменой использованию дорогих лабораторных животных. С ее помощью можно выявить наличие полиовируса в образце и антител к полиовирусу в крови. Новая методика позволила ученым выращивать вирус в течение многих поколений для получения варианта, способного к размножению без риска для организма (основное требование к живой ослабленной вакцине). Хотя Уэллер, Эндерс и Роббинс не испытывали интереса к получению самой полиомиелитной вакцины, их исследования продолжили путь к созданию таких вакцин в дальнейшем.

14. J. L. Melnick and N. Ledinko, Am. J. Hyg., 58 (1953) 207.

15. Роллерное культивирование клеток-http://allrefs.net

16. Методы культивирования вирусов-www.biofail.ru